[发明专利]一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种多亚基蛋白质及其制备方法、用途，具体涉及一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途，利用双质粒系统直接在大肠杆菌中表达一种脑靶向蛋白质CTB₅/EGFP-CTA2-TAT，属于基因工程技术、蛋白质分离纯化技术及医药生物工程技术相关领域；在医学领域中，本发明是一种脑靶向蛋白质，能用于脑靶向蛋白质的无创给药。

背景技术

蛋白质类药物活性高、毒性低、特异性强，已经成为医药产品中的重要组成部分。近年来有不少脑部疾病治疗用蛋白质类药物问世。蛋白质类药物应用于脑部疾病的最大障碍是血脑屏障。如果无法将药物递送到大脑，治疗也只能隔靴搔痒不得其法。使用脑内注射的方法虽然可以使药物绕过血脑屏障，有效地作用于脑部，但其具有创伤性且可能造成感染、出血等并发症，在临床应用中难以广泛开展及被患者接受。因此迄今为止，还没有一个能无创且特效治疗诸如老年痴呆、帕金森病等中枢神经系统疾病的药物。但相关疾病的发病率却在不断上升。寻找一种途径来协助大分子蛋白质药物通过血脑屏障具有广阔的应用前景。

2011年，康奈尔大学的Aaron J. Carman等宣布找到新的直接开启与关闭血脑屏障的方法：利用腺苷受体随时打开血脑屏障用药。这种非选择性开启血脑屏障的方式的安全性引起了极大争议。

血脑屏障由毛细血管的多层膜性结构组成，其严格的选择性开启机制对于生物来讲极为重要，它只允许诸如氨基酸、氧、血糖与水等营养分子通过。蛋白质类药物由血液进入脑组织间液的过程中，穿越毛细血管内皮细胞是关键性的步骤。与其他组织相比，脑毛细血管内皮细胞的胞饮作用很微弱。因此，对脑毛细血管内皮细胞来说，借胞饮作用转运大分子物质的能力非常有限。要想大分子蛋白质穿越血脑屏障，进入脑内，主要靠载体转运的方式，如：

（1）将血脑屏障中特异性蛋白的单克隆抗体作为载体，利用受体介导作用进入脑内；或者利用天然受体转运入脑途径，如胰岛素、转铁蛋白等特异性受体天然存在于脑毛细血管内皮细胞膜上，使用能结合这些受体的特异性载体用于药物转运；（2）血脑屏障内皮细胞带有一定的负电荷，使用带正电荷的材料如脂质体或纳米粒作为载体，利用吸附作用可运送药物进入脑内；（3）利用直接能携带蛋白质穿过细胞膜的肽类载体如穿膜肽（TAT），将蛋白质转运入脑。

目前，利用单克隆抗体等载体实现脑靶向给药依然是突破血脑屏障的主要手段，2012年将有两个老年痴呆治疗性单克隆抗体药物进入III期临床（http://www.nature.com/news/new-year-new-science-1.9730）。为提高入脑效率，降低副作用，越来越多的研究者试图整合多个载体优势，开发更高效更安全的脑靶向递药载体。如在传统的脂质体载体上掺入脑内受体的配体，抗原决定簇的抗体、靶向肽或穿膜肽，用以提高脑靶向性和载药能力。其中穿膜肽（TAT）成为新的研究热点。

1988年，研究者首次发现人类免疫缺陷病毒（HIV）的反式激活蛋白（TAT）能够跨膜导入细胞内，并保持细胞完好无损，称之为穿膜肽（TAT）。近年来发现并合成了大量穿膜肽，皆为富含阳离子短肽。大量研究证实这些短肽与异源蛋白质结合后，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞。Schwarze等通过腹腔注射穿膜肽与β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白，结果发现穿膜肽能携带该蛋白（分子量高达120 kDa）通过血脑屏障到达脑组织，并能保持酶活性。一系列穿膜肽的发现和应用给脑靶向系统的研发注入了新的活力。不过同时也有研究者担心，高穿膜活性的TAT必然伴随有高细胞毒性。研究发现，低剂量下使用TAT并无细胞毒性。Suhorutsenko J等的研究证实体外实验以10 μM 剂量，体内实验以5 mg/kg的剂量使用TAT是安全的。但同时研究也发现，GFP与穿膜肽融合蛋白在血脑屏障完好无损的情况下入脑效率并不高。

将药物分子搭载于各类靶向载体，可以成功穿越血脑屏障，但需克服载体/复合物产生的免疫反应和细胞毒性。理想的脑靶向递药载体应可以在低剂量下，无创伤给药并将药物高效送入脑内，而载体不进入脑部，避免免疫反应和细胞毒性。