[发明专利]一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途

权利要求书

1.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于：由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的EGFP-CTA2-TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CTB亚基构成。

2.根据权利要求1所述的具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于：该蛋白质中含有一个EGFP-CTA2-TAT亚基，EGFP氨基酸序列为SEQ ID NO.3，CTA2氨基酸序列为SEQ ID NO.4，TAT氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

3.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，其特征在于：包括用化学合成法和PCR法合成CTB和CTA2-EGFP-TAT的编码序列DNA，将这些DNA分步插入不相容表达载体，采用分步转化法将不相容双质粒转化至大肠杆菌BL21中，采用不相容双质粒表达的方法在大肠杆菌BL21中共表达蛋白质，得到6聚体（CTB）₅/EGFP-CTA2-TAT蛋白，具体方法如下：

（1）基因设计与获得

霍乱毒素B亚基基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；该序列是将野生型的CTB的核苷酸序列的信号肽基因序列切去，获得高表达量的的CTB基因；此外以天然的EGFP、CTA2、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点：Nhe I、EcoR I、Sac I和linker：GGGGS，通过密码子优化获得的新的基因，基因序列如SEQ ID NO:7所示，由北京普尔普乐公司全合成；

（2）基因工程菌的构建

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:8^9所示，对SEQ ID NO.6进行PCR扩增，通过Nco I和Xho I连入PET-28a载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-28a-CTB；

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:10^11所示，将SEQ ID NO.7进行PCR扩增，通过Nde I和Xho I酶切位点连入PET-22b（+）载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT ；

将PET-28a-CTB转化至大肠杆菌BL21感受态中，在30mmol/lKan抗生素压力下选择稳定存在的单菌落；将上述工程菌做成感受态，将重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT转化至该感受态中，在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌；

（3）多亚基蛋白质的表达纯化

在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌，在培养基中同时存在两种抗生素，缺乏任何一种质粒的细菌都会因为失去该质粒所携带的抗性而被相应的抗生素杀死，因此存活下来的细菌中同时含有这两种不相容质粒，并能够同时表达这两种质粒所携带的基因；其中EGFP与CTA2和TAT融合后为可溶性表达，CTB本身是包涵体表达，但由于形成的5聚体会与EGFP-CTA2-TAT重新组装形成6聚体CTB5/EGFP-CTA2-TAT，组装之后变为有活性的可溶性表达，无需进行包涵体复性，直接使用NI柱纯化得到目的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，其特征在于：通过基因工程手段，使用其他蛋白替换EGFP-CTA2-TAT亚基中的EGFP蛋白，可以将其他蛋白用于靶向入脑。

5.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用，其特征在于：多亚基蛋白质通过滴鼻给药，将EGFP-CTA2-TAT通过血脑屏障，靶向入脑。

6.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用，其特征在于：该蛋白质可与药物载体或药物活性成分组合制成药物组合物。