[发明专利]一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多重PCR检测方法，具体是一种能同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法。

背景技术

猪呼吸道疾病已成为影响养猪业的重要群发性疾病之一。研究表明，猪呼吸道疾病是由一种或多种细菌、病毒混合感染引起的疾病。通常由病毒或支原体首先侵袭呼吸道，破坏防御屏障，各种气源性病菌如多杀性巴氏杆菌以及副猪嗜血杆菌等进入呼吸道和肺部而造成继发或混合感染。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是的主要原发性病原之一，由于猪群感染MPS后难以治愈，且该病难以净化，避免接触MPS是最有效的预防措施，因此早期快速、准确地检测诊断十分必要。猪肺炎支原体是一种介于细菌和病毒之间的原核生物，其对培养条件要求较高，且在培养过程能够使PH值升高，通过酚红可以看到液体培养基变红，一般作为分离猪肺炎支原体的初步判断。然而这种检测费时且主观性强，难以达到准确诊断。另一个猪呼吸道常见病原体，猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)属革兰氏阴性菌，用印度墨汁等染料染色时可以看到清晰的荚膜，主要导致猪的出急性血性败血症、猪肺疫和萎缩性鼻炎，常与其他病毒和细菌呈混合感染或者继发感染。对巴氏杆菌的鉴定多采用形态观察、生理生化鉴定及其免疫学鉴定等传统的方法，这些方法耗时耗力且准确度差，因此仅仅依靠常规检验方法和临床经验很难对病原进行判断，进而会贻误动物疫病的防控的最佳时机；而副猪嗜血杆菌则是一种革兰氏阴性菌，能够引起猪纤维性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等，且常与猪呼吸道疾病有关。副猪嗜血杆菌是比猪肺炎支原体还要难培养的病原菌之一，目前对其的分离检测要比养殖场实际感染率少20％以上，其通常与猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、猪繁殖与呼吸病毒等病原菌混合感染，由于其培养条件苛刻，限制了对其的研究。因此，建立一种灵敏快速的检测猪上述呼吸道三种常见病原体方法十分必要。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。其可在同一PCR反应体系中同时加入多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。

发明内容

鉴于以上三种病原体猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌均是猪场PRDC的常见重要病原体，且往往是混合感染。传统的诊断技术如细菌分离、免疫学试验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中一次检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR检测方法。本发明方法简单，成本低廉，检测快速，效率高。

本发明本着一次检测就可以检出样品中三种病原体的目标，首先从已发表的文献中分别筛选出具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增这些靶点基因的引物，将该3对引物放在一个PCR反应体系，通过各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测三种病原体的三重PCR检测方法；本发明还进一步改进现场样品前处理方法，通过缩短前处理时间，进一步达到利用该三重PCR方法快速检测实际样品的目的。

本发明是通过以下的技术方案实现的。

一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法，具体步骤如下：

(1)筛选具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三个病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增上述靶点基因的引物；

(2)将3对引物放在一个PCR反应体系中，扩增靶点基因；

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：

扩增猪肺炎支原体的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；扩增猪多杀性巴氏杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；扩增副猪嗜血杆菌的上游引物的序列如SEQID NO.5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示(见表1)。

表1 引物序列及PCR产物