[发明专利]一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法

权利要求书

1.一种同时检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重PCR方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)筛选具有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三个病原体基因型特点的保守性基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，分别合成扩增上述靶点基因的引物；

(2)将3对引物放在一个PCR反应体系中，扩增靶点基因；

(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：

扩增猪肺炎支原体的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增猪多杀性巴氏杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；

扩增副猪嗜血杆菌的上游引物的序列如SEQ ID NO.5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，猪肺炎支原体的保守性基因片段为Sp36基因，猪多杀性巴氏杆菌的保守性基因片段为KMT基因，副猪嗜血杆菌的保守性基因片段为Trimeric autotransporter基因。

3.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，3对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至50μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。

4.根据权利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，对实际待检测样品前处理时，选择猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体都适宜的TSB培养基，将现场采到组织样品直接接种在TSB液体培养基中培养12h后，取菌液提取猪被检病原体DNA样品，作为模板，进行三重PCR检测。