[发明专利]一种检测大肠杆菌的电化学传感器及其制备方法

说明书

技术领域    

本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器，还涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。

背景技术   

大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，学名大肠希埃氏菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢，在自然界中分布十分广泛，尤其是在温血动物的肠道和粪便中大量存在。自1885年埃斯克里奇发现大肠杆菌以后，在此后相当长的一段时间内大肠杆菌一直被看做无害的非致病菌。随着研究的进展，人们根据菌体抗原的不同，将大肠杆菌分为150多型，大多属于肠道正常菌丛，有16个为致病性大肠杆菌。大肠杆菌对外界环境中可生存一定时间，因而被粪便污染的土壤、水源可能会含有致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌被婴儿和幼畜（禽）摄入后可导致严重的腹泻和败血症，如非致病性大肠杆菌进入人体胆囊、膀胱等器官也可引起炎症。大肠菌群值反映了食品等被粪便污染的程度，因而对食品、药品及饮用水中大肠杆菌菌群数进行检测是十分必要的。

检测大肠杆菌的传统方法主要有三种，分别是多管发酵法、滤膜法和平板计数法，这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。

发明内容   

本研究针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一种检测大肠杆菌的电化学传感器。

本发明还提供了检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为电极、普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层、大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层。

所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层厚度为90±5nm，大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100±10nm。

所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层是通过以下步骤得到的：

（1） 多壁碳纳米管进行羧基化；

（2）制备纳米金；

（3）使用步骤（1）和（2）得到的产物制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。

所述的电化学传感器，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物中普鲁士蓝：碳纳米管：金质量比为2:2:1。

所述的电化学传感器，优选

（1）电化学传感器用磷酸缓冲液冲洗之后，在E.coli溶液中孵育，再次用PBS冲洗，干燥后在大肠杆菌菌液中孵育完全，干燥后滴加HRP标记的大肠杆菌抗体，HRP标记的抗体通过与目标物之间的强识别能力，被修饰在电极表面；

（2）采用三电极系统，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，修饰电极为工作电极，以含对苯二酚和双氧水的PBS为工作底液采用差分脉冲伏安法检测，电位设置为-0.2到0.6 V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06 S，进行检测。

所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物，滴加到经过处理的电极表面，室温干燥，得到普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层；

（2）在普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物层上滴加无标记的大肠杆菌抗体，干燥，得到大肠杆菌抗体层；

（3）在大肠杆菌抗体层外包覆牛血清白蛋白，得到牛血清白蛋白封闭层。

所述的制备方法，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物的制备方法如下：

1）多壁碳纳米管羧基化，

2)制备纳米金，

3) 制备普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物。

所述的制备方法，优选多壁碳纳米管羧基化是通过以下步骤得到的：

 称取200 mg的多壁碳纳米管，加入160.0 mL的浓硫酸和浓硝酸的混合液中，其中浓硫酸和浓硝酸的体积比为3：1，混合均匀，离心，离心后倒去上清液加入去离子水水洗，继续离心，直到上清液呈中性，干燥即得。

所述的制备方法，优选普鲁士蓝-碳纳米管-纳米金复合物是通过以下步骤得到的：

(1) 4 mg羧基化的多壁碳纳米管分散到40.0 mL 0.01 M 的FeCl₃溶液中；

(２)边搅拌边将40.0 mL 0.01 M的K₃Fe（CN）₆溶液逐滴加入步骤（1）得到的FeCl₃溶液中；

(3) 将步骤（2）得到的溶液在10000 r/min条件下不断离心，倒去上清液，直到上清液呈无色；