[发明专利]一种鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物及应用与方法

说明书

技术领域

本发明属于鉴定检测技术领域，具体涉及一种鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因（SPS）表达量的引物及应用与方法。

背景技术

烤烟是世界上一种重要的经济作物，烟叶的品质与其糖含量密切相关，水溶性糖与氨基酸发生梅拉德反应可以产生多种香气物质。而蔗糖是主要的水溶性糖之一，它也是烟草光合作用的主要产物，蔗糖可以为烟草的生长提供碳源和能量，同时，也是细胞代谢的调控因子，可调节转运蛋白、贮藏蛋白和编码酶的基因的表达。

与蔗糖代谢密切相关的酶主要有转化酶（Invertase, Inv）、蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, SuSy)和蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase, SPS）。SPS是调控植物蔗糖合成的关键酶之一，其活力直接影响光合产物的分配，研究表明其与蔗糖形成呈正相关。SuSy是一种可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常认为，它主要起分解蔗糖的作用，能为细胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶与植物体内形成蔗糖梯度相关，Bachelier等研究表明，处在细胞壁中的转化酶能调节蔗糖从韧皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，而在液泡中的转化酶则可以调节蔗糖和己糖的贮存。

为揭示烤烟不同生育期蔗糖代谢的分子特点，为改善烤烟品质提供理论依据，需要明确不同生育期蔗糖代谢主要酶活性及酶基因的变化特点，目前，还没有一种较好的方法以达成以上目的，因此，开发一种能解决上述问题的测定方法是非常必要的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物；第二目的在于提供所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物的应用；第三目的在于提供所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的方法。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物的DNA序列为：

SPS-F2：5' GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3'

SPS-R2：5' CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3'。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物在鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量中的应用。

本发明的第三目的是这样实现的，包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括：

A、前处理：提取待测烤烟样品的基因组总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、PCR反应：以cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；

本发明通过对烤烟在团棵期、旺长期、现蕾期、打顶后、成熟期5个生育期的SPS酶基因的表达情况进行测定，从而明确不同生育期蔗糖代谢主要酶SPS酶基因的变化特点，揭示烤烟不同生育期蔗糖代谢的分子特点，并为改善烤烟品质提供理论依据。

附图说明

图1为烤烟品种云87在不同生育期SPS酶基因的表达情况示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因（SPS）表达量的引物，其DNA序列为：

SPS-F2：5' GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3'

SPS-R2：5' CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3'。

本发明的应用为所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物在鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量中的应用。

本发明所述的鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的引物鉴定烤烟蔗糖磷酸合成酶基因表达量的方法，包括前处理和实时荧光定量PCR反应，具体包括：

A、前处理：提取待测烤烟样品的基因组总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、PCR反应：以cDNA作为模板，进行PCR扩增。

B步骤中所述的PCR扩增的反应体系为：2×SYBR Premix 12.5μl，Forward Primer 0.4μM， Reverse Primer 0.4μM，Rox 1μM，加ddH₂O补充至25 μl。

B步骤中所述的PCR扩增的反应条件为：95℃ 30 sec 1个循环；95℃ 5 sec,58 ℃ 30 sec 45个循环；95℃ 30 sec，58 ℃ 1 min，95℃ 1 min  1个循环。

本发明的具体操作如下：