[发明专利]一种制备河豚毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药制剂领域，特别涉及一种制备河豚毒素的方法。

背景技术

河豚毒素(tetrodotoxin)是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，具有笼型原酸酯结构，如下所示：

其为白色结晶，无臭无味，微溶于水，不溶于有机溶剂；河豚毒素的结构特征是有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C-5和C-10位有一个半醛糖内酯连接着的分开的环。它是相当特殊的一种有机化合物，分子内的胍基与氮原子是质子化的，正羰酸也离解为阴离子，所以河豚毒素是以内盐形式存在。河豚毒素(tetrodotoxin)在临床具有戒毒和镇痛不成瘾的临床效果、也有其降压、局麻、抑瘤的方面的功效。

河豚毒素(tetrodotoxin)在原生物中的含量很少，一般在百万分0.1-5这个数量级上，所以在提取中前处理的量非常大，并且河豚毒素浸泡后有大量的游离氨基酸、肽类、脂肪、蛋白、胶体物质、无机盐等非目标产物存在于浸泡液中，国内外科研工作者基本都采用将浸泡液加热煮沸杂质变性沉淀，再通过速冷、沉降、过滤或离心的方法除去浸泡液中的蛋白等沉淀杂质。但此方法中由于要加热煮沸，而河豚毒素对热极不稳定，在80OC时加热30分钟损失11.8％，在90OC时加热30分钟损失31.2％，这样就不仅造成了河豚毒素的损失，而且降低了河豚毒素的收率。

对河豚毒素(tetrodotoxin)的提取分离国内外有很多相关报道，国内外科研工作者提取河豚毒素基本都是用氧化铝柱层析、滤纸层析、离子交换和碳柱吸附，还有用两步树脂交换的得到河豚毒素(tetrodotoxin)粗结晶，再用苦味酸成盐法反复重结晶，从而得到纯的河豚毒素结晶，纯度约为95％，但此方法不能完全将与河豚毒素性质极其相近的其异构体4-表河豚毒素(tetrodotoxin)分离出来。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可提高河豚毒素的收率且能较好的将河豚毒素与4-表河豚毒素分离开来的制备河豚毒素的方法。

本发明提供了一种制备河豚毒素的方法，具体包括如下步骤：

步骤一：浸泡

将河豚鱼肝或鱼子切成条或块后，用去离子水或纯化水浸泡，得到料液，浸泡至料液不再含毒为止；

步骤二：沉降

将步骤一所得的料液置于6～10℃沉降放置10～12小时，分出上清液，并将沉淀物离心并过滤除渣后再与上清液混合得到澄清液；

步骤三：絮凝

将步骤二所得的澄清液用氨水溶液调PH至7～9，加入絮凝剂溶液调节PH至4～6，搅匀，静置沉降，然后分出上清液，并将沉淀物经过高速离心并过滤除渣后再与上清液混合；

步骤四：离子交换

将步骤三混合所得的料液，上离子交换柱，交换至PH6.5～7.0,交换结束后用去离子水或纯化水冲柱至澄清，然后以醋酸溶液洗脱，收集含目标产物的组分，以氨水溶液调PH至5～7，减压浓缩得到浓缩液。

步骤五：低压柱层析

将步骤四所得的浓缩液和干硅胶拌好，上低压硅胶柱进行分离，并加入组成为正丁醇、醋酸和水的洗脱液进行洗脱，收集含目标产物的流出液部分，过滤得到滤液，减压浓缩得到浓缩液。

步骤六：高效液相色谱柱

将步骤五所得浓缩液注入平衡后的高效液相色谱柱,以醋酸溶液洗脱，收集含目标产物的流出液减压浓缩，得到浓缩液。

步骤七：结晶

将步骤六所得的浓缩液用氨水溶液调PH至8～9，冷藏，析出结晶，滤出，用无水乙醇洗涤，常温减压干燥即得河豚毒素高纯单体结晶。

所述步骤一中，所述河豚鱼肝或鱼子是切成1～2cm的条或块，置不锈钢浸泡槽中加1～2倍的去离子水或纯化水在6～10℃浸泡，并适时搅拌，18～24小时后将料液从不锈钢浸泡槽的下口放出至储料槽或沉降罐中。

所述步骤三中，是将步骤二所得的澄清液用25％的氨水溶液调PH至7～9，加絮凝剂溶液至PH4～6，以50～300rpm/min的速度搅拌5～10min，在温度为6～10℃下静置沉降18～24小时，分出上清液后，将沉淀物经过高速离心机，在转速为5000～10000rpm/min下离心20～40分钟，并过滤除渣后再与上清液混合。

所述絮凝剂为聚合硫酸铁、聚合硫酸铝、聚丙烯酰胺或聚合氯化铝，投放量为0.01～5g/L。