[发明专利]一种制备河豚毒素的方法

权利要求书

1.一种制备河豚毒素的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤一：浸泡

将河豚鱼肝或鱼子切成条或块后，用去离子水或纯化水浸泡，得到料液，浸泡至料液不再含毒为止；

步骤二：沉降

将步骤一所得的料液置于6～10℃沉降放置10～12小时，分出上清液，并将沉淀物离心并过滤除渣后再与上清液混合得到澄清液；

步骤三：絮凝

将步骤二所得的澄清液用氨水溶液调PH至7～9，加入絮凝剂溶液调节PH至4～6，搅匀，静置沉降，然后分出上清液，并将沉淀物经过高速离心并过滤除渣后再与上清液混合；

步骤四：离子交换

将步骤三混合所得的料液，上离子交换柱，交换至PH6.5～7.0,交换结束后用去离子水或纯化水冲柱至澄清，然后以醋酸溶液洗脱，收集含目标产物的组分，以氨水溶液调PH至5～7，减压浓缩得到浓缩液。

步骤五：低压柱层析

将步骤四所得的浓缩液和干硅胶拌好，上低压硅胶柱进行分离，并加入组成为正丁醇、醋酸和水的洗脱液进行洗脱，收集含目标产物的流出液部分，过滤得到滤液，减压浓缩得到浓缩液。

步骤六：高效液相色谱柱

将步骤五所得浓缩液注入平衡后的高效液相色谱柱,以醋酸溶液洗脱，收集含目标产物的流出液减压浓缩，得到浓缩液。

步骤七：结晶

将步骤六所得的浓缩液用氨水溶液调PH至8～9，冷藏，析出结晶，滤出，用无水乙醇洗涤，常温减压干燥即得河豚毒素高纯单体结晶。

2.根据权利要求1所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤一中，所述河豚鱼肝或鱼子是切成1～2cm的条或块，置不锈钢浸泡槽中加1～2倍的去离子水或纯化水在6～10℃浸泡，并适时搅拌，18～24小时后将料液从不锈钢浸泡槽的下口放出至储料槽或沉降罐中。

3.根据权利要求2所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤三中，是将步骤二所得的澄清液用25％的氨水溶液调PH至7～9，加絮凝剂溶液至PH4～6，以50～300rpm/min的速度搅拌5～10min，在温度为6～10℃下静置沉降18～24小时，分出上清液后，将沉淀物经过高速离心机，在转速为5000～10000rpm/min下离心20～40分钟，并过滤除渣后再与上清液混合。

4.根据权利要求3所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述絮凝剂为聚合硫酸铁、聚合硫酸铝、聚丙烯酰胺或聚合氯化铝，投放量为0.01～5g/L。

5.根据权利要求4所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤四中，是将步骤三混合所得的料液，上经氨化并用水冲至PH8～9的离子交换柱，交换至PH6.5～7.0,其中料液和离子交换树脂之间的量比为40～60ml/g，交换结束后用去离子水或纯化水冲柱至澄清，然后以5～10％的醋酸溶液洗脱，醋酸溶液与上的料液的体积比为1：90～180，收集含目标产物的组分，以氨水调PH至5～7，在0.9～1.0大气压下浓缩90～100倍，得到浓缩液。

6.根据权利要求5所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤四中的离子交换柱所用的离子交换树脂为D152弱酸型大孔丙烯酸阳离子交换树脂。

7.根据权利要求6所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤五中，是将步骤四所得的浓缩液，和干硅胶拌好，两者的量的比例为0.8～1ml/g，上低压硅胶柱进行分离，压力为0.7～0.9个大气压，加入组成为正丁醇、醋酸和水的洗脱液进行洗脱，洗脱液与上的料液的体积比为50:1，其中正丁醇、醋酸和水的体积比分别为5：3：1,收集含目标产物的流出液部分，用0.45um微孔滤膜过滤，得到滤液在0.9～1.0个大气压下90～100倍浓缩，得到浓缩液。

8.根据权利要求7所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤六中，是将步骤五所得浓缩液注入平衡后的高效液相色谱柱,高效液相色谱柱为C18柱，上样量为0.2～0.4ml，以体积百分比为0.4～0.6％的醋酸溶液洗脱，洗脱液与上的料液的体积比为80～150:1，用示差折光监测器监测，收集含目标产物的流出液在0.9～1.0个大气压下90～100倍浓缩，得到浓缩液。

9.根据权利要求8所述的制备河豚毒素的方法，其特征在于，

所述步骤七中，是将步骤六所得的浓缩液用体积分数为8～10％的氨水调PH至8～9，冷藏，析出结晶，滤出，用无水乙醇洗涤，在-1.1～-0.9个大气压下，常温干燥24～48小时即得河豚毒素高纯单体结晶。