[发明专利]稻瘟病菌无毒基因AvrPib特异性分子标记及其方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种稻瘟病菌无毒基因AvrPib特异性分子标记及其方法与应用。 

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是全世界数十亿人口赖以生存的重要粮食作物和重要的工业原料，同时也是多种病虫害的宿主。由病原真菌Magnapothe oryzae引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，每年都造成10～30%的水稻产量损失。而且该菌还能够侵染麦类、谷类等50多种禾本科植物。 

从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，使得抗病品种的抗性不稳定，以致抗病品种的感病化问题一直没有得到解决。传统的稻瘟病菌生理小种及其群体结构是通过基于鉴别品种的致病型鉴定而决定的。但是，这种方法划分的生理小种常因使用的鉴别品种不同而异，且工作量大，结果易受季节限制以及环境条件的影响，难以客观、真实地反映稻瘟病菌的生理小种及其群体结构。 

随着分子遗传学和分子生物学的发展，DNA水平上的分子指纹技术为研究在稻瘟病菌群体中无毒基因的遗传多样性提供了高效、快速的方法，避免了通过鉴别品种的致病型鉴定的大量工作，因此国内外都非常重视基于稻瘟病菌无毒基因的分子标记的开发及其应用工作。目前利用DNA分子标记已初步鉴定了40多个稻瘟病菌的无毒基因，并已经克隆了其中9个无毒基因，这为通过开发无毒基因的特异性分子标记来监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其群体结构的动态变化创造了条件。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中对稻瘟病无毒基因分子标记研究的缺陷，提供一种稻瘟病菌无毒基因AvrPib的分子标记。 

本发明的第二个目的是提供利用上述分子标记快速、准确检测稻瘟病菌无毒基因AvrPib的方法。 

本发明的第三个目的是提供上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib分子标记在稻瘟病菌群体检测中的应用。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 

稻瘟病菌无毒基因AvrPib的分子标记，其特征在于，所述分子标记由引物对AvrPibF1/R1和AvrPibF2/R2组成，所述引物AvrPibF1序列如SEQ ID NO：1所示，AvrPibR1序列如SEQ ID NO：2所示；AvrPibF2序列如SEQ ID NO：3所示，AvrPibR2序列如SEQ ID NO：4所示。

申请人在前期研究中通过图位克隆的方法克隆获得稻瘟病菌无毒基因AvrPib，通过对所述无毒基因两旁的基因组序列进行了比对分析。发现其两旁的基因组序列特异性高且变异性大，因此，申请人在所述无毒基因的编码区及其两侧设计2对引物（AvrPibF1/R1; AvrPibF2/R2），作为其特异性分子标记。 

由上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib的核苷酸序列产生的特异性的分子标记包括但不限于SNP（单核苷酸多态）、SSR（简单序列重复多态）、RFLP（限制性内切酶长度多态）、CAPS（切割扩增片段多态）。 

上述分子标记在稻瘟病菌群体监测中的应用。用这些标记可监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该无毒基因在田间自然群体中的分布情况。有助于基于无毒基因标记的稻瘟病菌的群体遗传结构的研究；也有助于水稻品种的抗病性鉴定和稻瘟病菌小种的鉴定；还有助于抗病品种的合理布局及轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生。 

本发明另一方面还提供了利用上述任一种引物对鉴定稻瘟病菌基因型的方法，该方法是通过常规PCR技术，利用所述引物对分别对待测稻瘟病菌株进行基于PCR扩增产物的基因型分型。 

申请人在前期研究中首先用分子标记AvrPib F1/R1对300个稻瘟病菌株进行基因型（带型）分析，为了排除引物匹配性造成的扩增误差，我们另外用AvrPib F2/R2对300个菌株进行基因型分析。个别菌株前后2次基因型存在差异，然后申请人参考菌株接种IRBLb-B的致病型结果，对2次基因型（带型）分析进行整合，见图5b。