[发明专利]鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、分子特异标记及其鉴别莼菜品种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地指一种鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、分子特异标记及其鉴别莼菜品种的方法。

背景技术

莼菜(Brasenia schreberi)为多年生水生植物和重要水生经济作物，隶属睡莲科或水盾草科或莼菜科。长期以来，特别是近几十年来，由于人类活动导致的生境破坏和过度开发利用，莼菜的群落面积与种群数量急剧减少，濒临灭绝,已被列为国家一级重点保护濒危野生植物。

莼菜很早就被奉为珍贵食品，还具有很高的药用价值。含有丰富的多糖、蛋白质、维生素和微量元素。其主要食用部分是富含胶质的未展开的幼嫩卷叶。在我国，莼菜主要产于浙江西湖地区、江苏太湖地区和湖北利川等地区。其分布表现为低海拔、亚热带季风性气候如浙江西湖地区、江苏太湖地区和高海拔、高寒地区、垂直地带性气候如湖北省利川(海拔1200～1400m)。因而致使莼菜有不同的品种和品质。

目前对莼菜品种的鉴别主要是依据植物的形态特征如花色、叶片正面和背面的颜色等，但有时很难区别开来，例如西湖莼菜品种和利川莼菜品种的花都为红色、叶片正面和背面的颜色都没有明显的差别。

目前还没有一种有效鉴别莼菜品种的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、分子特异标记及其鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、分子特异标记及其鉴别莼菜品种的方法。本发明采用ISSR分子标记技术构建的不同纯菜品种DNA指纹图谱，并形成分子身份证用于鉴定不同纯菜品种，克服了形态学上鉴别的不足。该鉴定方法对纯菜种质资源的科学利用与开发有重要的指导意义。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、所述特异性ISSR-PCR引物组由三条特异性引物组成，这三条特异性引物分别为：

1)P817：5’-CACACACACACACACAA-3’(5’-(CA)₈A-3’)；

2)P825：5’-ACACACACACACACACT-3’(5’-(AC)₈T-3’)；

3)P845：5’-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3’(5’-(CT)₈(A/T)G-3’)。

这三种引物是从60个引物进行筛选,从中选取扩增条带清晰、重复性较好的3个引物用于PCR扩增。

本发明提供了一种采用特异性ISSR-PCR引物组得到的分子特异标记，

1)采用特异性ISSR-PCR引物P817对莼菜基因组进行扩增，得到大小400bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

2)采用特异性ISSR-PCR引物P825对莼菜基因组进行扩增，得到大小750bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

3)采用特异性ISSR-PCR引物P845对莼菜基因组进行扩增，得到大小为2000bp、700bp、600bp、500bp和300bp的五个DNA片段；这五个DNA片段皆为分子特异标记。

本发明还提供了一种采用特异性ISSR-PCR引物组获得分子特异标记的方法，包括以下步骤：

1)选取莼菜幼嫩叶，提取DNA，得到莼菜基因组；

2)选取上述特异性ISSR-PCR引物组中任意一种引物，以莼菜基因组为模板，

PCR扩增程序反应条件：

PCR扩增程序为：

94℃预变性5分钟，然后进行下列循环：94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1.5min，共计35个循环；循环结束后，72℃延伸7min，得到PCR产物即为分子特异标记。

其中，所述PCR产物为：

1)采用特异性ISSR-PCR引物P817对莼菜基因组进行扩增，得到大小400bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

2)采用特异性ISSR-PCR引物P825对莼菜基因组进行扩增，得到大小750bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

3)采用特异性ISSR-PCR引物P845对莼菜基因组进行扩增，得到大小为2000bp、700bp、600bp、500bp和300bp的五个DNA片段；这五个DNA片段皆为分子特异标记。

本发明提供了一种利用特异性ISSR-PCR引物组鉴别莼菜品种的方法，包括以下步骤：

1)以莼菜基因组为模板，分别用以下三条特异性引物，