[发明专利]鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、分子特异标记及其鉴别莼菜品种的方法

权利要求书

1.一种鉴定莼菜品种的特异性ISSR-PCR引物组、其特征在于：所述特异性ISSR-PCR引物组由三条特异性引物组成，这三条特异性引物分别为：

1)P817：5’-CACACACACACACACAA-3’；

2)P825：5’-ACACACACACACACACT-3’；

3)P845：5’-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3’。

2.一种采用权利要求1所述特异性ISSR-PCR引物组得到的分子特异标记，其特征在于：

1)采用特异性ISSR-PCR引物P817对莼菜基因组进行扩增，得到大小400bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

2)采用特异性ISSR-PCR引物P825对莼菜基因组进行扩增，得到大小750bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

3)采用特异性ISSR-PCR引物P845对莼菜基因组进行扩增，得到大小为2000bp、700bp、600bp、500bp和300bp的五个DNA片段；这五个DNA片段皆为分子特异标记。

3.一种权利要求1所述采用特异性ISSR-PCR引物组获得分子特异标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)选取莼菜幼嫩叶，提取DNA，得到莼菜基因组；

2)选取上述特异性ISSR-PCR引物组中任意一种引物，以莼菜基因组为模板，反应体系为：

0.25mM的dNTP2.5μl1.5mM的引物1.5μl2.5U Taq酶0.5μlPCR Buffer3.5μl(10ng)的莼菜基因组4μl超纯水13μl合计25μl

PCR扩增程序反应条件：

PCR扩增程序为：

94℃预变性5分钟，然后进行下列循环：94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1.5min，共计35个循环；循环结束后，72℃延伸7min，得到PCR产物即为分子特异标记。

4.根据权利要求3所述采用特异性ISSR-PCR引物组获得分子特异标记的方法，其特征在于：所述PCR产物为：

1)采用特异性ISSR-PCR引物P817对莼菜基因组进行扩增，得到大小400bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

2)采用特异性ISSR-PCR引物P825对莼菜基因组进行扩增，得到大小750bp的DNA片段，即为分子特异标记，或者；

3)采用特异性ISSR-PCR引物P845对莼菜基因组进行扩增，得到大小为2000bp、700bp、600bp、500bp和300bp的五个DNA片段；这五个DNA片段皆为分子特异标记。

5.一种利用权利要求1所述特异性ISSR-PCR引物组鉴别莼菜品种的方法：其特征在于：包括以下步骤：

1)以莼菜基因组为模板，分别用以下三条特异性引物，

P817：5’-CACACACACACACACAA-3’；

P825：5’-ACACACACACACACACT-3’；

P845：5’-CTCTCTCTCTCTCTCTWG-3’；分别进行PCR，其中，反应体系为：

0.25mM的dNTP2.5μl1.5mM的引物1.5μl2.5U Taq酶0.5μlPCR Buffer3.5μl(10ng)的莼菜基因组4μl超纯水13μl合计25μl

PCR扩增程序反应条件：

PCR扩增程序为：

94℃预变性5分钟，然后进行下列循环：94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1.5min，共计35个循环；循环结束后，72℃延伸7min；得到PCR产物，

2)将得到PCR产物置于1.5％琼脂糖凝胶中，进行电泳分离，得到电泳图；

3)将P817、P825和P845三种引物扩增得到电泳图，进行对比分析，得到ISSR指纹图谱，从而鉴定不同莼菜品种。