[发明专利]一种非洲猪瘟抗原及其制备的荧光纳米晶试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒抗体检测领域检测领域，特别是涉及一种用于非洲猪瘟病毒抗原蛋白和利用该抗原蛋白制备的非洲猪瘟病毒抗体的快速检测荧光纳米晶试纸条。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种严重危害猪及野猪的动物传染病，其病程短，死亡率高达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中列为一类动物疫病。目前，全球已有49个国家报道曾经发生或仍有非洲猪瘟流行，主要集中在非洲、欧洲、美洲和欧亚接壤地区，尤其是2007年以来非洲猪瘟先后在格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯等国暴发，造成巨大的经济损失，也严重威胁我国的养猪业。目前，我国虽然还没有发现ASF疫情，但根据周边国家的发病情况，我国已面临ASFV传入和流行的严重威胁，一旦发病，由于无有效的疫苗和药物可以预防和治疗，将造成巨大的经济损失，甚至会对我国养猪业造成毁灭性打击。由于没有有效的疫苗，检测技术是目前监测和控制非洲猪瘟的有效方法。因此，为了有效地防制非洲猪瘟病毒传入我国，及时准确地掌握进出境贸易中疫情疫病状况，迫切需要发明特异性强、灵敏度高的现场快速检测试纸条，应用于受威胁地区的监测工作中，其具有重要的现实与实践意义。

检测非洲猪瘟的方法包括抗原检测方法和抗体检测方法，由于我国还未有该病的发生，检测抗原的方法难以验证，故不具有现实意义。而检测非洲猪瘟抗体则具有重要意义，且其不存在疫苗免疫抗体的干扰。ASFV整个基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，编码150～200种蛋白质。其中VP73蛋白是ASFV的主要结构蛋白，病毒离子20面体衣壳的重要组成部分，产生与病毒感染的晚期，约占整个病毒粒子蛋白的32％。VP73蛋白在ASFV结合和进入易感细胞的过程中有很重要的作用。ASFV大多数分离毒株免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原型。研究表明，不同区域ASFV分离株诱导产生的抗VP73蛋白抗体的相应抗原表位都相当保守。VP73蛋白免疫原性很稳定，可以被用来作为血清学检测和免疫制剂。

目前，国外检测非洲猪瘟抗体的方法包括酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫印迹试验和对流免疫电泳试验等，但这些方法均需要在专业实验室中开展，不能满足现场快速检测的实际工作需要。免疫层析技术自问世以来，得到了迅速发展，已广泛应用于生物检测技术领域，特别是胶体金免疫层析技术具有操作简单、结果清楚、易于判断和保存、无需任何仪器设备等优点，适合于临床的快速检测和基层、农村等流行病学调查，但是其也存在检测灵敏度低的不足。

高特性荧光纳米晶的制备及其在免疫检测中的应用是目前十分活跃的前沿研究领域。将荧光纳米晶新型标记材料引入到免疫层析试纸条中，通过荧光信号来得出检测结果，可以克服胶体金试纸条灵敏度不足的缺点。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作方便非洲猪瘟病毒抗体的快速检测荧光纳米晶试纸条。

本发明包括一种非洲猪瘟病毒重组抗原，其制备方法包括以下步骤：

a)根据非洲猪瘟病毒VP73基因序列人工设计并合成该抗原表位的重组基因

序列，所述如序列表SeqIDNo.1所示；

b)将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；

c)将步骤b)获得的PCR产物，并与线性载体连接，构建重组表达载体；

d)将重组表达载体导入原核表达体系，诱导蛋白表达；

e)对表达产物进行纯化后获得所述非洲猪瘟的重组抗原。

进一步的，步骤d)中，最佳诱导剂及浓度为IPTG1.0mmol/L，最佳诱导时间为3h。

进一步的，步骤b)中，用于所述重组基因序列特异性扩增的PCR引物为：

P1:TAGATCCATGGCTTCTGGTGGCGCGTT

P2:ATTCTCGAGGTCGACTTAGTGATGG，

本发明的内容还包括所述的非洲猪瘟病毒重组抗原，在制备用于检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂中的应用。

本发明的内容还包括一种非洲猪瘟抗体检测荧光纳米晶试纸条，包括：依次连接并固定于PVC衬板上样品垫、荧光纳米晶标记物释放垫、包被权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗原作为检测线和兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体作为质控线的硝酸纤维素膜以及吸水垫。