[发明专利]犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法。

背景技术

犬新孢子虫(Neospora caninum)为专性细胞内寄生原虫，隶属于原生动物门(Protozoa)、顶复亚门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、新孢子虫亚纲(Neosporidia)、新孢子虫属(Neospora)。1988年，Dubey等人首次从一只下肢瘫痪的犬体内分离到该虫体，并且将其命名为犬新孢子虫。犬新孢子虫的终末宿主是犬，牛、羊、猪、马、兔等多种哺乳动物都可以作为中间宿主，它的寄生部位是中枢神经系统、脑、肝、肌肉及其它内脏组织。新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病，该病主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病，给畜牧业带来巨大的经济损失。国内对犬新孢子虫的研究尚属起步阶段，尚缺少自主知识产权的犬新孢子虫体分离、体外增殖等技术方法。

原有方法(Yamane et al.1997)中报道的犬新孢子虫的分离方法，通过以下步骤实现：无菌采集新鲜死亡的胎儿脑组织，称量10克放入研钵中，加入胰蛋白酶使终浓度为0.5％，37℃孵育20min，添加适量液氮迅速研磨，得到匀浆液经细胞滤器过滤后离心，并悬浮于添加抗生素等双抗的无菌PBS中，最后将含有虫体的混悬液接种于含有10％胎牛血清培养基的单层Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)上，每24h更换培养液，直至观察到犬新孢子虫速殖子。这一分离方法繁琐复杂，极易污染，研磨组织飞溅的液氮容易伤害操作人员，胰蛋白酶也会影响组织中分离的虫体和培养细胞的生长发育，分离效率较低，失败率高。

体外培养犬新孢子虫常用细胞为Vero细胞系等传代细胞，原有方法(Davison et al.1999)中报道的体外培养犬新孢子虫的方法，以Vero传代细胞系培养犬新孢子虫速殖子为例，将复苏的Vero细胞接种到含8％犊牛血清的DMEM培养液中，当Vero细胞长成单层后接种10⁴个左右虫体，每隔12小时更换培养液，应用倒置显微镜观察犬新孢子虫速殖子增殖情况，接种4-5日后虫体增殖达到高峰期。Vero细胞的传代培养程序繁琐，而且犬新孢子虫在Vero细胞系中培养生长和增殖缓慢，尤其冻存虫体复苏、接种Vero细胞其复苏和增殖时间较长，极大限制了急需虫体试验的研究进展。

专利“一种新的犬新孢子虫速殖子的体外培养和染色方法”采用MCF-7乳腺细胞为宿主细胞，采用RPIM-1640培养基进行培养，采用倒置显微镜观察胞外新孢子虫速殖子的数目，从第2天开始缓慢增长，第3天开始迅速增长，在第4天达到高峰。该方法依旧存在增殖时间长的问题。

目前，尚没有应用原代人胚肾细胞-293细胞体外增殖培养犬新孢子虫的报道。

发明内容

本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，本发明的目的在于提供一种简便、快捷、实用性强的犬新孢子虫的分离方法。

为实现上述目的，本发明的犬新孢子虫的分离方法通过这样的技术方案实现：取一定体积浓度为10kU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素的双抗，应用一次性注射器无菌采集犬新孢子虫感染的动物脑组织，该犬新孢子虫感染的动物脑组织体积为该双抗体积的两倍以上，将该双抗加入到采集的该犬新孢子虫感染的动物脑组织；

采用不同规格的一次性注射器按照针头直径缩小的顺序反复吸吹。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述吸吹步骤中，反复吸吹至少10次以上。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，针头直径的大小不小于27G。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述一次性注射器，选自12G针头、20G针头、27G针头中任意一种以上的针头。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，还包括：将经过处理的所述犬新孢子虫感染动物脑组织接种到对数生长期的Vero细胞中培养。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养采用DMEM完全培养液。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液含有1％双抗和8％犊牛血清。

本发明所述的犬新孢子虫的分离方法，其特征在于，所述培养液每隔24小时更换一次。