[发明专利]检测草甘磷的时间分辨荧光免疫试剂盒及其检测方法在审

专利信息
申请号: 201410548542.2 申请日: 2014-10-16
公开(公告)号: CN105572369A 公开(公告)日: 2016-05-11
发明(设计)人: 洪霞;杜霞;刘静 申请(专利权)人: 镇江先创生物科技有限公司
主分类号: G01N33/577 分类号: G01N33/577
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 212009 江苏省*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 检测 草甘磷 时间 分辨 荧光 免疫 试剂盒 及其 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属于生物检测领域,具体的说,涉及一种检测草甘磷的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。

背景技术

随着农业科技的不断发展,我国很多制药厂能生产出高效、广谱、低毒的除草剂,草甘膦便是其中的1种。草甘膦为内吸传导型广谱灭生性草甘膦,主要通过抑制植物体内烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化,使蛋白质的合成受到干扰导致植物死亡。

草甘膦以内吸传导性强而著称,不仅能通过茎叶传导到地下部分,而且在同一植株的不同分蘖间也能进行传导,对多年生深根杂草的地下组织破坏力很强,能达到一般农业机械无法达到的深度。因此,能除去田间400多种杂草,为农村的每个家庭节省了很多劳动力,为我国的农业生产作出了很大贡献。但在我国农业生产发展中,由于只研究了草甘膦的除草作用,却没有研究中毒后的解救方法,所以草甘膦也给我国的畜牧业发展和人类带来一定的危害。

草甘磷残留分析一般使用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)及气相色谱质谱联用技术(GC/MS),这些方法灵敏、准确,可以同时测定多种药物,但需要昂贵的仪器,样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高,而且需专业人员操作,很难满足对样品进行现场、批量、快速检测的需要。因此,开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。

而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价,且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对草甘磷检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题,本发明的目的在于提供一种蔬菜水果中草甘磷残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测蔬菜水果中草甘磷的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法,用于定量或定性地检测蔬菜水果中草甘磷残留量。

本发明目的之一是这样实现的:检测草甘磷的时间分辨荧光免疫分析试剂盒,其关键在于由多孔包被板、缓冲液、草甘磷标准品溶液、抗草甘磷的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。

本发明目的之二是这样实现的:检测草甘磷的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法,包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测,其关键在于:

(1)免疫原的制备:将半抗原草甘磷与牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到免疫原(草甘磷-BSA);

(2)包被原的制备:将半抗原草甘磷与卵血清白蛋白(OVA)偶联,得到包被原(草甘磷-OVA);

(3)单克隆抗体的制备:

a.用步骤(1)的免疫原(草甘磷-BSA)免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗草甘磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;

b.以体内诱生腹水法大量制备抗体,使用ProteinG柱进行纯化,获得抗草甘磷的单克隆抗体IgG;

c.用步骤(2)的包被原包被96孔包被板;

(4)样品的前处理及检测:

取包被有包被原(草甘磷-OVA)的多孔包被板,加入50μL的草甘磷到各自的微孔中,加50μL以缓冲液稀释的抗草甘磷抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗3次,加以缓冲液稀释的100μLEu3+-兔抗鼠抗体,25℃~37℃振荡0.5~1小时,洗涤液洗6次,加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps,根据标准曲线计算样品中的草甘磷含量。

上述的固相载体是多孔包被板,采用96孔的多孔包被板作为固相载体。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测草甘磷。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面:第一,特异性单克隆抗体制备,用偶联的免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗草甘磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以体内诱生腹水法大量制备抗体,使用ProteinG柱进行纯化,获得抗草甘磷的单克隆抗体IgG。第二,Eu3+标记抗体的制备。

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