[发明专利]人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。

从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如CD45、CD14、CD11，及一些共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD31。一般认为MSCs表达CD105、CD73、CD44、CD90、CD106、CD29等。2006年国际细胞治疗协会(the international society for cellular therapy，ISCT)间充质组织干细胞委员会(Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee)对间充质干细胞的最低标准做了规定：第一，MSCs必须是可以在塑料培养器皿中贴壁生长的细胞；第二，MSCs流式检测必须≥95％表达CD105，CD73，CD90抗原，同时必须≤2％表达CD45，CD34，CD14，CD11b，Cd79α和HLA II；第三，MSCs必须具备在体外诱导称为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。因此，一般通过以上三点综合鉴定MSCs。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪MSCs，其生物学性质与骨髓MSCs相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。目前所报道的MSCs主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法分离获得。相对于骨髓MSCs，脂肪MSCs有一下优势：

1、脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富。且脂肪组织取材容易，吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，这一点尤其利于临床应用；

2、脂肪MSCs获取效率要优于骨髓。细胞克隆形成实验表明，MSCs只占到成人骨髓的(0.2～1)×10-5。而脂肪组织经胶原酶消化后，其中主要的细胞类型脂肪细胞，很容易通过浮力而去掉，所获得的细胞克隆形成率是骨髓MSCs的100～500倍；

3，从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的脂肪干细胞，对于急性心肌梗塞等疾病的快速治疗具有重要意义。在局部麻醉的情况下，成人骨髓的获取量通常不超过40ml，能获得大约1.2×109个有核细胞，其中包含大约2.4×104个MSCs。如果想获得更多的骨髓，则需要全身麻醉，则增加了病人痛苦和发生并发症的风险；而一次吸脂手术可获得超过200ml的脂肪组织，且每100ml都能获得大约2×108个有核细胞，其中含有大约1.2×108的干细胞，相当于相同体积骨髓的2000倍。

由此可见，在相同条件下，脂肪更具临床应用潜力。

由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem(自体脂肪来源的MSCs)成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。脂肪MSCs已成为继骨髓MSCs后干细胞领域另一个备受关注的热点。

MSCs本身不表达II类主要组织相容性抗原及共刺激因子CD80、CD86或CD40，其本身具有低免疫原性，然而，研究显示：MSCs却对主要免疫效应细胞包括T细胞，B细胞，NK细胞的增殖和功能活性均有显著抑制作用，同时调节递呈细胞如DC细胞的活性，激活调节性T细胞(T regulatory cells)。MSCs对主要免疫效应细胞作用如下：