[发明专利]一种提高脐孢木霉菌合成木霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术和生物防治领域，特别是涉及一种提高脐孢木霉

菌（Trichoderma brevicompactum）0248合成木霉素的方法。

背景技术

木霉素（trichodermin）——单端孢霉烯类化合物的一种，该化合物对常见9种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用，对黄瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果，因此被认为是具有广阔生防应用前景的抗真菌物。木霉素主要由木霉属真菌脐孢木霉菌（T. brevicompactum）发酵产生。为了提高木霉素的开发价值和市场竞争力，不少研究者采用物理诱变和诱导等方法以期提高木霉素产量，但在现阶段，木霉菌产素水平离工业化进程相距甚远。研究组从大蒜中分离筛选到一株产木霉素的内生真菌——脐孢木霉菌（T. brevicompactum）0248，也一直致力于提高木霉素发酵单位的研究。

发明内容

在研究提高脐孢木霉菌0248产素水平的试验中发现，一株具有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化株在含有潮霉素B的培养基中发酵产木霉素的浓度比脐孢木霉菌0248要高。

本发明通过获得含潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株，并在液体发酵培养基中加入潮霉素B，从而提高发酵液中木霉素的浓度。该发明为提高木霉素的发酵单位提供了一种可靠的方法。

本发明的目的是针对野生型菌株脐孢木霉菌0248产素水平低的不足，提供一种提高木霉素产素水平的方法；本发明的另一目的是提供了一株高产木霉素的转化菌株。

本发明所述的脐孢木霉菌0248，分类命名为Trichoderma brevicompactum。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC No. 6985。

 

本发明目的通过以下技术方案来实现：

1. 以pCAMBIA0380质粒为基础，通过限制性内切酶酶切和T4 DNA连接酶连接反应，将pSilent-1质粒上的潮霉素B抗性基因连接到pCAMBIA0380质粒的T-DNA区形成新的质粒pCAMBIA0380-H质粒；

2. 通过热激转化，将pCAMBIA0380-H质粒转化至农杆菌AGL-1中，并提取阳性克隆子中质粒，然后通过PCR验证阳性克隆子是否正确；

3. 将经PCR验证了的阳性克隆子农杆菌（命名为AP03H）与脐孢木霉菌0248孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素B的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板筛选阳性转化株，获得的阳性转化株（命名为AZ1）；

4. 使用含潮霉素B的液体培养基(培养基组成为：牛肉膏10 g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl 2 g/L，潮霉素B 0.1 g/L )培养AZ1，培养条件为：28 ℃，180 r/min，振荡培养72 h，发酵液经5000r/min离心10min，上清液用于木霉素含量的测定；

5. 木霉素的检测

方法：采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱（以5 %苯基甲基硅氧烷为固定液，30 m×320 μm×0.25 μm）；检测器：氢火焰离子检测器（FID）；检测器温度270 ℃；进样口温度250 ℃；柱温度：程序升温，初始温度100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温至260 ℃保持5 min；载气：氮气；流速1.5 mL/min。

本发明的有益效果：

本发明获得了含有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株AZ1，该菌株在含潮霉素B的液体培养基中木霉素产量为野生型菌株的6.1倍，显著提高了发酵液中木霉素的浓度，这为木霉素产量的提高提供了一种可靠的方法。

附图说明

图1 质粒pCAMBIA0380-H构建流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提高木霉素产量的方法作进一步描述。

实施例1 (含潮霉素B抗性基因片段质粒的制备)

按以下步骤进行：

（1）使用LB培养基在37 ℃，180 r/min的条件下培养pSilent-1及pCAMBIA0380质粒的宿主菌，12 h后采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，分别提取pSilent-1及pCAMBIA0380质粒。