[发明专利]一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用

说明书

本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的酮还原酶，以及使用该酮还原酶催化合成(R)‑HPBE，进而进一步合成普利类药物的酶‑化学合成方法。还提供了编码该酮还原酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酮还原酶，该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。

背景技术

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE,CAS号：90315-82-5)是一种手性仲醇，它是合成众多血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(即普利类药物)的关键手性砌块。

普利类药物主要用于治疗心力衰竭、高血压。目前在中国抗高血压药物市场上主要有ACE抑制剂、钙拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂和β-受体阻滞剂四类抗高血压药物。普利类药物近年受到沙坦类药物的影响，销量有所下降，但由于受到欧盟新标准和国内一些厂家退出的影响，价格较为稳定。

自1977年Ondetti等研究开发了第一代的卡托普利后，普利类药物已经拓展到80多个衍生物，常见的几种普利药物如上所示。普利类药物由于具有疗效显著、不良反应小、作用时间长等优点，在临床上仍有广泛的应用前景。由于(R)-HPBE是该药物的关键手性中间体，对于(R)-HPBE合成新方法的研究仍具有较大的实用意义和工业应用前景。

合成(R)-HPBE的方法包括化学法和生物法。其中，化学法是由价廉易得的原料出发，经过多步反应最终合成(R)-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸经过多步反应生成2-羟基-4-苯基丁酸，再经过去消旋化和酯化作用合成(R)-HPBE；再如由乙二酸二乙酯和苯丙酸乙酯作为起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后经过不对称氢化得到(R)-HPBE。化学法在产物规模上具有较为明显的优势，可达到500公斤的生产规模，但是，化学法要用到重金属Pt等污染环境的催化剂，无法满足绿色化学的要求且成本较高。另外，化学法存在收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低等缺点，所以不适合进行规模化生产的进行。

目前生物法合成(R)-HPBE主要有两种途径，一种是利用脂肪酶来拆分rac-HPBE得到(R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后经过乙酯化得到(R)-HPBE。另一种途径是用酮还原酶OPBE或OPBA进行不对称还原，生成(R)-HPBE或(R)-HPBA，(R)-HPBA可经过进一步酯化合成(R)-HPBE。利用酮还原酶进行不对称还原，理论得率可以达到100％，而脂肪酶的理论得率最高只能达到50％，酮还原酶具有一定的优势，但酮还原酶催化反应通常需要额外添加价格昂贵的辅酶NAD⁺/NADP⁺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的不对称还原反应制备(R)-HPBE反应中收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低、或者需要添加价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的酮还原酶，以及使用该酮还原酶催化合成(R)-HPBE，进而进一步合成普利类药物的酶-化学合成方法。还提供了编码该酮还原酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种酮还原酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。