[发明专利]一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用

权利要求书

1.一种酮还原酶，其是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的酮还原酶的分离的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的。

4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体选自质粒、噬菌体或非噬菌体病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述的质粒选自pET21a。

7.一种包含权利要求4～6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体，其特征在于通过将权利要求4～6任一项所述的重组表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞中制得。

8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。

9.一种重组酮还原酶的制备方法，包括培养权利要求7或8所述的重组表达转化体，以及从所述培养物中获得重组酮还原酶。

10.一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂，其是权利要求7或8所述的重组转化体的培养物，或通过将所述培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用所述转化体细胞加工的制品。

11.权利要求10所述的所述的催化剂，其特征在于所述的转化体细胞加工的制品为由转化体细胞得到的提取物或通过对提取物中的酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

12.一种权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为式I所示的化合物：

其中，R选自H、甲基、乙基，R’选自H或Cl，n为0或2。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯。

14.根据权利要求12-13任一项所述的应用，其特征在于所述应用包括下述步骤：在pH5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，在权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

15.根据权利要求14所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为10～1000g/L；所述的酮还原酶、重组酮还原酶或催化剂的用量为1～100U/L；所述的葡萄糖用量为50～100g/L，葡萄糖脱氢酶的用量为100～1000U/L。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应液中含有0～1mmol/L的NAD⁺。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于；所述的不对称还原反应在振荡或搅拌条件下进行；所述的不对称还原反应的温度为20～45℃。

18.一种合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括使用权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯进行不对称还原反应。