[发明专利]一种制备BMP‑2蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备BMP-2蛋白的方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是由骨基质分泌的一种疏水性蛋白，属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员，由Urist等人于1965年首次提出，1972年定义，并于1982年首次从脱钙骨基质提取物中分离得到。BMP家族包括BMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12和BMP-14等，其中BMP-2具有明显诱导未分化的成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合。BMP-2是骨生成的启动因子，可以加速骨的重建，是骨修复基因治疗的理想目的基因，是目前唯一能诱导异位成骨的细胞因子，因而成为骨组织工程学研究中最重要的生长因子。目前，BMP-2已成功地用于治疗骨不连和骨缺损的修复。

BMP-2的活性形式是二聚体，在成熟肽单链中有七个半胱氨酸残基，形成三个肽链内二硫键，两条肽链间再通过一个二硫键连接后才具有活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备BMP-2蛋白的方法。

本发明提供的制备BMP-2蛋白的方法，包括如下步骤：

将种子液按10％的体积比接种至装有发酵培养基的发酵罐，然后按照如下参数进行第一阶段发酵：

培养温度：37.0℃；

培养阶段溶氧：>40％；

培养pH：7.0-7.3；

接种种子液后的起始溶氧：>90％；

接种种子液后的起始转速：200rpm；

接种种子液后的起始通气量：3.0SLPM；

待发酵体系的OD_600nm值为9时加入IPTG并使其浓度为1.0mM，然后按如下参数进行第二阶段发酵，第二阶段发酵即诱导发酵：

诱导温度：37.0℃；

诱导发酵阶段溶氧：>40％；

诱导发酵阶段pH：7.20-7.40；

诱导发酵时间：4-6小时；

包括第一阶段发酵和第二阶段发酵在内的发酵过程中，采用补料培养基进行补料；

所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；

所述种子液为OD_600nm值＝3.0-5.0的重组菌菌液；所述重组菌的制备方法如下：将具有所述BMP-2蛋白的编码基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：1.0g/100mL胰蛋白胨、0.5g/100mL酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgSO₄、0.05g/100mL CaCl₂、0.5g/100mL Na₂HPO₄和0.25g/100mL KH₂PO₄；

所述补料培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。

所述BMP-2蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2所示。

所述重组质粒的制备方法具体如下：将序列表的序列2自5’末端第64-477位核苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

所述方法中，“采用补料培养基进行补料”的方案如下：对于装有3L所述发酵培养基的5L发酵罐来说，从发酵体系OD_600nm＝1.5开始补料，初始补料速度为2ml/min，每半小时增加0.4ml/min，增加至6ml/min后再每半小时减少0.4ml/min，直至补料速度为0。

所述方法中，“采用补料培养基进行补料”的方案如下：对于装有30L所述发酵培养基的50L发酵罐来说，从发酵体系OD_600nm＝1.5开始补料，初始补料速度为12ml/min，每半小时增加2.4ml/min，增加至36ml/min后再每半小时减少2.4ml/min，直至补料速度为0。

所述种子液的制备方法具体如下：挑取所述重组菌的单克隆，接种至种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm值＝3.0-5.0，即为种子液。