[发明专利]一种制备BMP‑2蛋白的方法

权利要求书

1.一种制备BMP-2蛋白的方法，包括如下步骤：

将种子液按10％的体积比接种至装有发酵培养基的发酵罐，然后按照如下参数进行第一阶段发酵：

培养温度：37.0℃；

培养阶段溶氧：>40％；

培养pH：7.0-7.3；

接种种子液后的起始溶氧：>90％；

接种种子液后的起始转速：200rpm；

接种种子液后的起始通气量：3.0SLPM；

待发酵体系的OD_600nm值为9时加入IPTG并使其浓度为1.0mM，然后按如下参数进行第二阶段发酵，第二阶段发酵即诱导发酵：

诱导温度：37.0℃；

诱导发酵阶段溶氧：>40％；

诱导发酵阶段pH：7.20-7.40；

诱导发酵时间：4-6小时；

包括第一阶段发酵和第二阶段发酵在内的发酵过程中，采用补料培养基进行补料；

所述方法中，“采用补料培养基进行补料”的方案如下：对于装有3L所述发酵培养基的5L发酵罐来说，从发酵体系OD_600nm＝1.5开始补料，初始补料速度为2ml/min，每半小时增加0.4ml/min，增加至6ml/min后再每半小时减少0.4ml/min，直至补料速度为0；

所述方法中，“采用补料培养基进行补料”的方案如下：对于装有30L所述发酵培养基的50L发酵罐来说，从发酵体系OD_600nm＝1.5开始补料，初始补料速度为12ml/min，每半小时增加2.4ml/min，增加至36ml/min后再每半小时减少2.4ml/min，直至补料速度为0；

所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；

所述种子液为OD_600nm值＝3.0-5.0的重组菌菌液；所述重组菌的制备方法如下：将具有所述BMP-2蛋白的编码基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：1.0g/100mL胰蛋白胨、0.5g/100mL酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgSO₄、0.05g/100mL CaCl₂、0.5g/100mL Na₂HPO₄和0.25g/100mL KH₂PO₄；

所述补料培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述BMP-2蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组质粒的制备方法如下：将序列表的序列2自5’末端第64-477位核苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述种子液的OD_600nm值＝4.0。

5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述诱导发酵的时间为5小时。