[发明专利]一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，适用于宫颈癌细胞与组织抗原的准确、定量检测以及QD-SA复合物应用中的质量控制，还涉及该试剂盒在定量检测宫颈癌细胞与组织中抗原中的用途。

背景技术

宫颈癌是目前严重威胁女性健康的妇科恶性肿瘤，其发病呈日益年轻化且发病率有逐年上升趋势。有数据统计，全世界每年约有宫颈癌新发病例50万，约有2313万妇女死于该病，其中80%的新发病例是发生在发展中国家，而我国每年宫颈癌新发病例约占全世界发病人数的1/3。因此，提高宫颈癌的早期诊断水平对于宫颈癌的预后有重要意义。传统的宫颈癌诊断方法包括影像学检查（如阴道镜检查）、实验室检查（如肿瘤标志物测定、细胞学检查及HPV检测等）和病理组织活检（如宫颈锥切及宫颈组织活检等）。传统检查方法固然有其实用性，但也存在弊端，因此，建立新的诊断和筛查技术对降低宫颈癌的死亡率至关重要。

量子点是近年发展起来的一种新型纳米发光粒子，相对于传统染料，它具有荧光强度高、荧光寿命长、抗光漂白能力强、激发波谱宽、发射波谱窄及可同时激发多重荧光等独特的光学特性。这些特性使其在生物医学领域，尤其是作为一种新型标记物应用于肿瘤的分子病理及体外成像诊断方面，应用十分广泛。QDs对宫颈癌的检测是通过构建特异性探针来实现的，即QDs与单个抗体、多肽或者其他生物小分子结合，制成高品质的荧光QD探针，靶向结合单个肿瘤细胞，从而实现宫颈癌的早期诊断。

p16基因是一种多肿瘤抑制基因，是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。在对p16的进一步研究中，人们用免疫组织化学的方法检测p16蛋白后发现，在90％以上的宫颈癌病例中存在p16蛋白的高表达，且会随着宫颈癌病情的发生发展而呈现逐渐升高的趋势，但在正常细胞内无表达。因此，P¹⁶可作为宫颈癌特异性检测的靶向目标，通过构建量子点-链霉亲和素系统-生物素-抗原抗体复合物特异性靶向探针，进而实现宫颈癌的早期检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，并提供上述量子点试剂盒的用途。该试剂盒可与目前用于检测宫颈癌细胞与组织抗原的生物素化抗体相结合，可以达到快速、经济、灵敏、高效而准确地对肿瘤抗原进行检测。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征是：该试剂盒包括 a）固定液，b）渗透液，c）洗涤液，d）封闭液，e）单克隆抗体P^16INK4A，f）生物素-兔抗鼠IgG复合物，g）量子点（QDs）标记的链霉亲和素（SA）复合物探针；采用水溶性CdSe/ZnS核壳型量子点标记的链霉亲和素复合物作为荧光探针，与检测宫颈癌细胞上的生物素化抗原抗体复合物结合，从而间接标记并检测宫颈癌细胞上的P¹⁶抗原。所述的固定液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与多聚甲醛溶液按体积百分比100：4配制。渗透液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与吐温-20按体积百分比100：0.1配制。洗涤液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：1配制。封闭液是0.02M pH 7.6 TBS缓冲液，与正常兔血清按体积百分比100：10，并与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：5配制。

所述的单克隆抗体P^16IN4A在宫颈癌细胞上对应的受体呈高表达（达90%以上），而在其他正常细胞上呈低表达。所述的量子点为CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、InP、InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS 中的一种纳米粒子或任意几种纳米粒子的组合。

所述的生物素-兔抗鼠IgG复合物制备方法如下：

（1）取15 mg 生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；

（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。

 所述的QD-SA复合物制备方法如下：