[发明专利]胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物传感器识别元件快速测定BOD的方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物传感器领域，提供了用于生化需氧量生物传感器的胶原纤维固定化大肠杆菌生物识别元件的制备及其使用方法。

背景技术

 生化需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）是一项衡量水质污染程度的重要指标，表示水中有机物经微生物生化作用分解时所消耗的溶解氧量。国内外测定BOD值的传统方法是5日生化需氧量接种稀释法(BOD₅法)，即样品在20±1℃条件下培养5d，测定样品培养前后的溶解氧，两者之差即为5日生化需氧量，但此法耗时耗力、重现性差且不宜现场监测。近年来，微生物传感器法由于其测定时间短、操作简便、易于现场监测等优点而被逐渐应用于BOD的检测。

 BOD微生物传感器主要由固定化微生物、信号转换装置和信号输出装置组成，其中固定化微生物对传感器的灵敏度、响应范围等性能均有重要影响。常见的微生物固定化载体有聚乙烯醇、活性交联树脂、溶胶凝胶等，但这些载体大多传质性能及生物相容性较差，使得由其制得的传感器普遍存在响应值较小、测量范围较窄、微生物利用率较低等问题。

胶原纤维是一种天然高分子材料，金属离子锆（Zr）、铁（Fe）等改性后的胶原纤维具有良好的传质性能、生物相容性、热稳定性、耐生物降解性及广泛的酸碱适应范围等优点。将其作为微生物固定化载体制备微生物传感器，可较大程度增加固定微生物用量并保持较高微生物利用率。

大肠杆菌是一种易于培养、呼吸活性强、适应范围广的细菌，金属离子锆（Zr）改性后的胶原纤维对大肠杆菌具有较大的固定量且能使其保持较稳定的活性。本专利以金属离子锆（Zr）改性胶原纤维（ZICF）为载体固定大肠杆菌作为生物识别元件制备BOD微生物传感器，基于ZICF良好的传质性能及生物相容性，本发明对传感器灵敏度、测量范围等性能的提升有较大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，该方法包括选择胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件，制备胶原纤维固定化大肠杆菌生物识别元件的方法，利用胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件对BOD的快速测定方法，以及该固定化大肠杆菌的保存方法和该微生物敏感膜的活化方法。

  所述胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件的原因如下：

  1) 胶原纤维作为一种天然高分子材料，具有通透性好、耐曝气强度高、生物相容性好、成本低廉、机械性能好、酸碱适应范围广等优点；

2) 经金属离子改性后的胶原纤维在保持胶原纤维原有优良性能的基础上，更具备了良好的耐热性和耐生物降解性；

3) ZICF良好的传质性能使得传感器中固定微生物用量可适当增大，从而拓宽传感器的线性响应范围，提升传感器的灵敏度； 

4)  胶原纤维固定大肠杆菌具有固定量大、微生物活性高的特点，这些特点可使传感器获得更宽的线性响应范围；

  5) 胶原纤维固定化大肠杆菌作为生物识别元件具有使用寿命长，识别元件保存和活化方法简单的特点。

 所述金属离子锆（Zr）改性胶原纤维固定化载体（ZICF）由已有方法制备（发明专利：胶原纤维固载金属离子吸附材料及其制备方法和用途，专利号： 200410040145.0）。

所述固定化大肠杆菌的制备方法：称取干重0.5g ZICF置于无菌水中浸泡5-12h。大肠杆菌在营养肉汤培养基中活化培养18-24h，经离心、无菌生理盐水清洗后收集细胞，将其加入无菌生理盐水中制得菌悬液，并调节菌悬液浓度为10^-7-10¹⁰ cfu/mL。将ZICF过滤后加入上述菌悬液中，37℃震荡吸附5h后用无菌生理盐水清洗至无游离菌检出，即得胶原纤维固定化大肠杆菌。

所述生物识别元件的制备方法：每次称量湿重为0.10-0.30g的胶原纤维固定化大肠杆菌，将固定化大肠杆菌置于两层200目尼龙网之间，使之形成一层固定化微生物膜，使用时将该膜紧贴于溶解氧电极头前的半透膜上，并用电极帽固定。