[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生和食品检验技术领域，涉及一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。

背景技术

E.coli O157:H7(enterohaemorrhagic Escherichiacoli，EHEC)是肠出血性大肠杆菌的主要血清型,世界卫生组织于1997年将其列为新的食源性致病菌，它主要通过食用被污染的食物传染给人类。由EHEC O157:H7引发的疫情美国1982年首次报道,自此以后世界许多国家发生感染流行,日本和美国相继在1996年和2006年发生了大规模的人感染EHEC O157:H7疫情,引起广泛关注。我国仅1999年江苏省发生的人感染EHEC O157:H7事件, 就导致上百人死亡。该病原菌可引起人腹泻、出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒症等。而且强致病性、高致死率以及抗生素治疗可能加剧病情等,已构成严重的公共卫生问题。目前对其的鉴定包括选择性培养、生化和免疫、毒素的细胞学试验等，都存在费时费力、检测时限长等弊端。

对于突发性传染病，快速检测和鉴定病原体是控制疫情的关键。传统的EHEC O157∶H7的实验室检测方法主要是细菌培养，但周期长，工作量大；而PCR和DNA探针法等分子生物学检测技术虽然时效性好，但对检测人员要求高，且设备昂贵,不利于基层单位推广应用。因此，研究开发一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉、适于基层推广的检测方法, 对EHEC O157:H7疫情的监控将起到积极作用。

Notomi等（2000年）首次报道环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域设计特异性引物，在等温条件下（60～65℃）利用Bst DNA聚合酶，高效、快速、特异性扩增靶序列。1h左右即可完成核酸扩增反应，其扩增效率可达到10⁹个数量级，与传统技术相比，具有操作简单，快速、灵敏、高效、特异、不需要特殊的仪器设备、观察结果方式多,凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术。等优点。目前，该方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有相关论文报道。

本专利将环介导等温扩增技术（LAMP)）与横向流动试纸条技术（LFD）相结合，针对大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因保守序列设计引物，建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichiacoli，EHEC) O157∶H7的LAMP-LFD检测技术。该技术敏感性好，简单快速，1h内完成检测工作，且不需要使用精密昂贵的仪器设备，不需要通过琼脂糖凝胶电泳检测结果，避免了高致癌EB的污染，通过横向流动试纸条可直观的得到检测结果。本试剂盒操作简便，作为EHEC O157:H7的初筛工具,尤其适用于基层检验检疫机构,为EHEC O157:H7的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组，它包括：

O157-F3    AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 

O157-B3    GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 

O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA

SEQ ID NO：3 

O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 

SEQ ID NO：4

O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5

O157-LB    TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6；

其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。

本发明进一步公开了采用用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD特异性引物组制成的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：

（1）LAMP反应液：