[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成：

O157-F3       AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 

O157-B3     GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 

O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA

SEQ ID NO：3 

O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 

SEQ ID NO：4

O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5

O157-LB          TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6；

其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。

2.一种含有权利要求1所述用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD特异性引物组的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：

（1）LAMP反应液：

 LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF  0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL

超纯水

Bst酶（8U/μL）  

（4）横向流动试纸条

（5）用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物；其中的引物指的是：

O157-F3       AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 

O157-B3     GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 

O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA

SEQ ID NO：3 

O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 

SEQ ID NO：4

O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5

O157-LB      TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6

所述的O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。

3.一种采用权利要求2所述试剂盒，用于检测食源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP-LFD方法，其特征在于，按如下的步骤进行：

（1）LAMP扩增反应体系为：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；加入样品DNA模板1至5μL；用超纯水补充至终体积25μL；

（2） 扩增反应过程：在恒温水浴锅内95 ℃条件下变性5min，在63 ℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

（3）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min；

取出后在5至7min内读取检测结果；

（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。

4.权利要求1所述用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组在制备用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD试剂盒中的应用。