[发明专利]一种细胞法生产手性烯醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到挪威假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(2S,3R)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇的技术。

背景技术

手性（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化的不对称催化具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。

 (2S,3R)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(2S,3R)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇。

发明内容

本发明采用挪威假丝酵母细胞催化制备(2S,3R)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应式如下：

底物S-亚环己基甘油醛（1）和4-溴-1-丁烯（2）经挪威假丝酵母催化催化，得到产物(2S,3R)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇（3）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用挪威假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应1和2反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多挪威假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用挪威假丝酵母菌株为ATCC 36586 ，其催化反应效果最佳。

培养介质：

1、　种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；

2、培养液成份：葡萄糖25-30 g/L，甘油25-30 g/L，玉米胚芽粉30-40 g/L， KH₂PO₄ 9-11 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，pH值为6.0。

2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

酵母细胞制备。挪威假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30-31℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.9-1.2V/（V分钟），30-31℃培养30-36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。

由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用苎麻纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化催化，浓度降低时，底物从苎麻纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被苎麻纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与苎麻纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与苎麻纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与苎麻纱布的比率为0.36-0.38。具体吸附时，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，即得到吸附了底物的苎麻纱布。调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.36-0.38。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。