[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、发酵技术领域。

背景技术

氨肽酶是一类外肽酶，从蛋白质或肽链的N末端选择性切割氨基酸残基，作用范围较广。由氨肽酶的切割特性可知，氨肽酶的酶解产物为小肽和游离氨基酸。因此，氨肽酶具有非常重要的工业应用价值，能够既有效又环保地对蛋白质进行相关的水解反应，氨肽酶的应用广泛，可协助切掉肽链末端疏水性氨基酸，脱除蛋白水解物的苦味；与不同的内切酶复配，参与蛋白质的深度水解；制备多功能活性肽；还可以作为N端测序工具酶和医疗诊断用酶。蛋白序列测定的工具可以用到亮氨酰氨肽酶，作为融合产物或重组蛋白的固定剂。氨肽酶在医学研究中发现，其有助于许多疾病的治疗，可以用于从分子水平来研究许多生理现象。脯氨肽酶可以用于清除神经毒性的化学毒剂和有机磷农药，一方面可以用作解毒剂，另一方面可以用作环境的消毒剂。

微生物的发酵培养优化策略往往从培养基的优化和发酵过程控制两方面入手，目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某种微生物的培养基配方和发酵过程控制策略，且不同的微生物所适合的培养基和发酵过程控制策略都不尽相同，没有一种培养方法能够适合多种微生物的发酵培养，所以对某一特定微生物需要采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和试验方法将培养基组成和发酵过程控制等发酵策略组合优化才能选择出最适合的培养方法。

氨肽酶在食品、工业、医药等方面具有重要的研究价值和应用价值，但目前氨肽酶的发酵生产存在产量低的问题，如何提高产量成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的组合优化策略，解决现有发酵工艺中产量低，难以工业化应用的问题。

本发明的技术方案，一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，步骤为：以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为出发菌株，将培养基优化和发酵过程控制组合优化，得出适合重组枯草芽孢杆菌培养方法；将重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基后，摇床培养到对数生长期，接种一定量的种子液到调整后的发酵培养基中，用发酵罐进行发酵培养，每3h取样测定酶活力等参数。

发酵培养基的优化：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

（2）摇床发酵培养：将产酶促进剂加入到发酵培养基中，再将种子液以5％的量接种到上述发酵培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养36h；

所述发酵培养基为：可溶性淀粉6g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L，氯化钴0.6 mmol/L、用去离子水配制；

所述产酶促进剂包括渗透压调节剂，有机酸盐，表面活性剂；

（3）将所得发酵液离心后取上清液，测定酶活力，确定产酶促进剂加入的种类和用量；

所述产酶促进剂包括渗透压调节剂（如氯化钾）、表面活活性剂（如吐温80）、有机酸盐（如谷氨酸钠、酒石酸钾）等。

发酵罐发酵工艺具体步骤为：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

所述种子培养基为氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；

（2）发酵培养：将培养好的种子液以5％的量接种到7L发酵罐中，发酵罐的装液量为4L，通入无菌空气，搅拌转速250-450rpm，通气比为1.2﹕1，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30％，发酵培养30h；

发酵培养过程的前12h的发酵培养温度为37℃，12h后发酵培养温度调整为30℃；发酵培养到15h时，一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5g/L；

所述发酵培养基为可溶性淀粉20g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L、氯化钴0.6 mmol/L、氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L、用去离子水配制；