[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法

权利要求书

1.一种重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于：以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为出发菌株，将培养基优化和发酵过程控制组合优化，得出适合重组枯草芽孢杆菌培养方法；将重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基后，摇床培养到对数生长期，接种一定量的种子液到调整后的发酵培养基中，用发酵罐进行发酵培养，每3h取样测定酶活力参数；

重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600详见中国专利CN102492645A。

2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于摇床培养步骤为：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

（2）发酵培养：将产酶促进剂加入到发酵培养基中，再将种子液以5％的量接种到上述发酵培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养36h；

所述发酵培养基为：可溶性淀粉6g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L、氯化钴0.6 mmol/L，用去离子水配制；

所述产酶促进剂包括渗透压调节剂，有机酸盐，表面活性剂；

（3）将所得发酵液离心后取上清液，测定酶活力，确定产酶促进剂加入的种类和用量。

3.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌发酵制备高产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于发酵罐发酵工艺具体步骤为：

（1）种子液的制备：将-40℃甘油管保存的重组枯草芽孢杆菌菌种Bacillus subtilis WB600接入到种子培养基中，使用回转式恒温摇床进行培养，控制摇床转速为220rpm，培养温度为37℃，培养10h，得到种子液；

所述种子培养基为氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L；

（2）发酵培养：将培养好的种子液以5％的量接种到7L发酵罐中，发酵罐的装液量为4L，通入无菌空气，搅拌转速250-450rpm，通气比为1.2︰1，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30％，发酵培养30h；

发酵培养过程的前12h的发酵培养温度为37℃，12h后发酵培养温度调整为30℃；发酵培养到15h时，一次性补加500g/L的葡萄糖补料液，使得发酵液中还原糖浓度为5g/L；

所述发酵培养基为可溶性淀粉20 g/L、豆粕20 g/L、酵母膏18 g/L、甘油2 mL/L、磷酸氢二钾6 g/L，氯化钴0.6 mmol/L、用去离子水配制；产酶促进剂为：氯化钾0.1 mol/L、谷氨酸钠0.6％、酒石酸钾0.7％、吐温-80 2.4 mL/L；

（3）参数测定：发酵过程中，每隔3h取样，测定亮氨酸氨肽酶酶活力、生物量。