[发明专利]一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、HBV引物T7引物和nT7引物、HBV检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有乙型肝炎病毒的血清或血浆样品进行核酸扩增检测，具有检测效率高，准确度高的特点，能够检测出HBV的A‑I 9个基因型，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的乙型肝炎病毒(HBV)的核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)，肝癌患者中，75％以上由HBV所致。

我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50～100万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。

HBV已发现有9个基因型(A～I)，每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、C基因型占优势，其中北方地区(长江以北)主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C/D重组基因型为主；A型和B1亚型罕见。

乙型肝炎病毒的主要检测方法有：血清学检查、生化学检查及分子生物学法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。

核酸检测主要涉及核酸提取与和核酸扩增检测。

目前血清和血浆中病毒核酸的提取方法主要有煮沸裂解法、离心柱提取法及磁珠法。煮沸裂解法不能有效去除抑制成分，且易于污染；柱提取法操作过程复杂，效率低，且不易于实现自动化；磁珠法能快速实现核酸的分离与纯化，易于实现自动化操作。

国内已有多种基于实时荧光PCR技术检测HBV-DNA的试剂盒应用于实际检测中，这些试剂盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之处：1)特异性不是很好，不能检测出所有HBV的九个基因型(A-I)；2)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。3)检测灵敏度低，大部分约在500IU/ml左右；

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT)是一种直接针对核酸(DNA和RNA)快速扩增RNA并检测的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性结合实际样本溶液基质进行专门、针对性地设计。目前尚无针乙型肝炎病毒DNA进行实时荧光恒温扩增检测的试剂盒，进一步，能同时对乙型肝炎病毒DNA和RNA的提取、并扩增的核酸恒温扩增检测产品也未见报道。

发明内容