[发明专利]一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化和骨折危险为特征的一类疾病。其引起的危害逐渐受到人们的关注，积极开发防治骨质疏松药物也慢慢成为医学界活跃的领域之一。对于药物的研发，实验模型显得尤为重要。细胞模型，其作用环节单一，难以体现药物整体观，也无法评估药物在体情况；传统的动物如小鼠等作为药物筛选模型因费用高，造模时间长，无法对其在体观察和定位等缺陷，局限了药物高通量筛选的应用。

斑马鱼，一种热带鲤科鱼。由于它具有体积小，繁殖周期快、胚胎透明、骨骼发育迅速、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，而逐渐被应用于骨骼疾病模型的研究。临床上，经常或大量使用糖皮质激素治疗的病人会出现骨质疏松副作用，小鼠等动物应用糖皮质激素也可导致骨质疏松。从鱼类到哺乳动物，糖皮质激素系统具有高度的保守性，因此，糖皮质激素也被应用于斑马鱼骨质疏松模型的建立。骨骼染色是对骨骼最基本的研究方法，传统的染色试剂有钙黄绿素(calcein),槲皮素(quercetin)和茜素红(Alizarin red)等。其中，茜素红染色主要是与钙离子形成螯合物，是目前研究斑马鱼骨矿化情况的主要方法。但该方法存在实验步骤繁琐，花费时间长，染色效果不稳定等缺陷。

转基因技术是近年来应用于斑马鱼进行疾病模型或基因分子水平研究的新方法。传统转基因斑马鱼技术是通过显微注射将外源DNA如报告基因GFP(green fluorescent protein)或(RFP,red fluorescent protein)注射到受精卵中，以便其整合到斑马鱼基因组中并在特定组织和器官中表达。这种方法存在转基因效率低，并且亲代遗传率也低的缺点。

发明内容

为了解决以上问题，本发明通过应用tol2-gateway技术(它利用Tol2转座子特性，在构建组织特异性启动子带报告基因如GFP或RFP的表达载体后，将该质粒和体外合成的相应转座酶mRNA共注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中。基于转座子的特性，便可形成高效的基因转移和遗传，大大提高了初代注射成功率及传代稳定性。)构建了骨骼报告绿色荧光的转基因斑马鱼，并用该品系斑马鱼构建了糖皮质激素诱导的骨质疏松斑马鱼模型，进而将该模型应用于抗骨质疏松药物的高通量筛选中。

因此，本发明的目的在于提供一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其包括以下步骤：

1、斑马鱼的繁殖；

2、转基因斑马鱼的构建；

3、采用药物对转基因斑马鱼进行造模；

其中，在步骤2所述的转基因斑马鱼的构建过程中，应用tol2-gateway转基因技术分别构建质粒5’Entry clone:p5E-Osterix，Middle Entry clone:pME-nls EGFP和3’Entry clone:p3E-Poly A，并将上述质粒进行三片段LR反应，获得表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA，最后将所述表达质粒与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎细胞中。

在本发明优选的实施方案中，步骤2中所述的表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA的结构如附图1所示。

在本发明优选的实施方案中，步骤3中所采用的药物为地塞米松DEX，其最佳浓度为10μM。

在本发明的技术方案中，还进一步包括对骨质疏松斑马鱼模型进行评估验证的步骤。

在本发明优选的实施方案中，所述的评估验证包括药物评估验证、骨矿化定量分析、行为学分析和骨相关因子水平变化监测。

在本发明进一步优选的实施方案中，药物评估验证所采用的药物分别为地塞米松DEX和淫羊藿黄酮FE，其中淫羊藿黄酮FE的最佳拯救浓度为1μg/ml。

本发明再一方面还提供了本发明所述的骨质疏松斑马鱼模型在筛选抗骨质疏松药物中的应用。

在本发明优选的实施方案中，所述药物分别为骨吸收抑制剂类药物、骨形成促进类药物、骨矿化促进类药物以及中药类药物。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述的骨吸收抑制剂类药物为双膦酸盐、降钙素、雌激素、雌激素受体调节剂和依普黄酮，骨形成促进类药物为氟制剂、甲状旁腺激素制剂、活性维生素D制剂，骨矿化促进类药物为钙剂、维生素D及其活性代谢物。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述的中药类药物为淫羊藿、熟地、杜仲、丹参、黄芪和蛇床子。