[发明专利]一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子诊断领域，具体涉及一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

地中海贫血(Thalassemia)是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α地中海贫血(简称α地贫)和β地中海贫血(β地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国，是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万地贫基因突变携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚，广西地中海贫血以α地贫为主，基因携带率约为18％，广东省地贫的基因携带率约为16％，海南省约为7％，还有四川、湖南以及江西省，基因携带率约为人群的2％左右。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致产后大出血等严重的产科并发症，另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国乃至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。

地贫的发病分子机制经过多年研究已非常清楚，α基因与β基因序列也非常明确。地贫基因突变的类型有明显种族与地域差异性，在全世界已发现200多种突变，而中国至今发现三十余种基因突变，但是98％左右集中在23种类型的突变，并在东南亚地区范围内，其分子机制大致相同。α地贫有三种比较常见的点突变，分别是122CAC→CAG,125CTG→CCG,142TAA→CAA点突变；β地贫的分子基础以点突变为主，其中常见的为17种:-32(C>A),-30(T>C),-29(A>G),-28(A>G),CAP+40-+43(-AAAC),Initiation codon ATG>AGG,CD14/15(+G),CD17(A>T),CD26(G>A),CD27/28(+C),IVS-1-1(G>T),IVS-1-5(G>C),CD31(-C)，CD41-42(-TCTT)，CD43(G>T)，CD71/72(+A),IVS-2-654(C>T)。

目前已经有基于荧光定量PCR，反相斑点膜杂交方法，以及液相芯片方法和试剂盒来检测以上地贫基因点突变。反向斑点膜杂交方法，最终的检测结果是基于目测杂交点的杂交信号深浅度来判断，因此膜芯片上只设计了针对检测突变的探针；而液相芯片检测结果是把杂交的荧光信号转化数字信号，因此液相芯片检测点突变时，需要设计针对野生型的探针，和针对突变型的探针，最终计算野生型探针和突变型探针信号的比值来确定样本的基因型。在检测基因点突变时，最关键的因素是需要保证探针杂交的特异性，最理想的结果就是野生型探针只与野生型DNA片段杂交；突变型探针只与突变型DNA片段杂交，但实际工作中不会出现以上绝对的情形，总会有一些非特异性的背景信号产生。检测地贫基因型的准确度取决于特异性信号所产生的信号值是否较非特异性探针产生的信号值有较大的差异，以便容易区分。若野生型和突变型DNA有时只存在一个碱基的不同，按照常规方法设计的探针，往往会产生较高的非特异性杂交信号，导致不能明显地区分野生型还是突变型DNA片段。

锁核酸(LNA-Locked Nucleic Acid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。锁核酸修饰的探针在降低了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的熔解温度(Tm值)，并且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此锁核酸修饰的探针在增加检测基因点突变的特异性方面具有很大的灵活性。

发明内容：