[发明专利]一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下所示：

其中N表示针对野生型的探针；M表示针对突变型的探针；“+”符号3’端的碱基为锁核酸修饰碱基，探针的5’端带有连接臂。

2.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示：

3.根据权利要求1所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针，其特征在于，所述的连接臂为NH2-C12连接臂。

4.一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物序列如下所示：

P1-F：5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCAG-3’，P1-R：5’-CCTCAGGAGTCAGATGCACC-3’；

P2-F：5’-AGAAGTCTGCCGTTACTGCC-3’，P2-R：5’-ATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’；

P3-F：5’-ACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3’，P3-R：5’-TGAGGTTGTCCAGGTGAGC-3’；

P4-F：5’-CATGCCTCTTTGCACCATTCTA-3’，P4-R：5’-TAGCTGGATTGTAGCTGCTATTAG-3’；

P5-F：5’-TAAGCCACTGCCTGCTGGT-3’，P5-R：5’-CAGGAGGAACGGCTACCGA-3’；

在下游引物的5’端带有荧光标记修饰。

5.根据权利要求4所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的PCR引物，其特征在于，所述的荧光标记修饰为生物素荧光标记修饰。

6.一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测试剂盒，包括多重PCR反应液、耐热DNA聚合酶、微珠、引物及探针，其特征在于，所述的引物为权利要求4所述的引物，所述的探针为权利要求1所述的探针。

7.一种基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、探针耦联：合成权利要求1所述的探针，将探针分别连接到不同编码的微珠上；

(2)、样本PCR扩增：提取样本基因组DNA，利用权利要求4所述的PCR引物，通过多重PCR的方法把要检测的突变位点一次性全部扩增出来，得到PCR产物；

(3)、PCR产物和耦联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号：在杂交缓冲液中加入步骤(1)中得到耦联有探针的微珠，得到杂交缓冲液和微珠的混合液，然后将PCR产物与杂交缓冲液和微珠的混合液进行杂交，得到杂交产物，将杂交产物与荧光标记试剂混合进行反应，通过液相芯片检测仪分析每个样本的荧光强度中位数，当样本的荧光强度中位数高于平均背景的荧光强度中位数加10倍标准差，则是特异性杂交，完全匹配杂交的探针的杂交信号会强于不完全匹配的杂交信号，通过比较针对同一基因位点完全匹配的探针，和带有突变的探针的杂交信号，判断出样本中该突变位点的基因型。

8.根据权利要求7所述的基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的样本PCR的扩增体系为：总PCR反应体系为25μl，包括0.2mM dNTPs、2mM Mg2+、1U·TaqHS，以及25ng标本基因组DNA，空白对照用无菌水代替标本基因组DNA；PCR的扩增程序为：95℃5分钟；95℃30秒、50℃45秒、72℃30秒，30次循环；95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒，20次循环；72℃10分钟。