[发明专利]玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地说，涉及玉米中甘蔗花 叶病毒的RT-PCR及RealTimePCR检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)PCR，是1985年由 美国PE-Cetus公司的科学家KaryBanksMulis发明的一种可在体外快 速扩增特定基因或DNA序列的分子生物学技术。这项技术是根据生物 体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定DNA 序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA 序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于 医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的 发展产生了革命性的影响。

PCR技术的原理是：DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小 段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与 单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度 和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此 为起始点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核 苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR反应中，通过双 链DNA的高温变性(denaturation)、引物与模板的低温退火(annealing) 和适温延伸(extension)这三步反应反复循环。每一循环中所合成的 新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR合成的特定DNA序列产量 随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。

植物病毒为害是农业生产上损失最大的病害之一，有“植物癌症” 之称。在自然界中，植物病毒侵染植物的现象相当广泛，很多植物病 毒病害与人们生活密切相关，例如在经济上非常重要的农作物，像粮 食、油料、果树、蔬菜、药材、林木和花卉等各种植物。一种病毒可 侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。不同植物病毒病害 可以通过各种途径传播；病叶汁液接种传毒；介体传毒，即各种昆虫 (叶蝉、飞虱、蚜虫)线虫；真菌作媒介传毒，还可经土壤和种子传 毒。植物病毒对作物的危害可使农业生产受到巨大的损失。病毒侵染 首先引起寄主在生物化学上和代谢上的变化，接着产生细胞结构上的 变化，最后导致宏观症状的出现。客观症状可分为两大类：一类是由 细胞和组织结构发生的变化而引起的如颜色变化、黄化、褪绿、坏死、 枯斑和缺水等；另一类是由于细胞和组织的不正常生长引起的，细胞 的结构并不发生变化，如植株矮化、木栓化形成、叶片卷曲，变形。 病变可造成植物产量减少，果实减小。在病害流行期间，常常使感病 作物造成毁灭性的灾害。一般危害性在一年生种子繁殖作物，多年生 作物和营养繁殖作物上有所不同。在一年生种子繁殖的作物上，如稻、 麦、棉和蔬菜等，可以采取一些预防措施，减轻当年病害的发生程度， 一般不影响下一季的发病。有些种子传染的病害，当年发病的轻重在 不同程度上影响下一年发病程度。对木本植物和果树等经济林木危害 更大一些。木本植物一旦发病，以后连年都发病，必要时只有采取铲 除的方法来防止病毒传染到健康的植物上。例如遍布欧美的马铃薯退 化病，被带进我国薯区后，1955年在河北中部发病率为85-90％，减产 50-70％，造成当地马铃薯不能留种，产量很低，给农民带来巨大的损 失。因此，高效的病毒鉴定或检测技术是防治植物病毒病害的关键。