[发明专利]玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法

权利要求书

1.玉米中甘蔗花叶病毒的RT-PCR检测用引物对，其特征在于， 所述引物对包括：

正向引物F：5'-GTGATGTTGCTGCACTCCCAA-3'

反向引物R：5'-AAGTGGAGGCACTGGATCTGG-3'。

2.含有权利要求1所述引物对的用于RT-PCR及RealTimePCR检 测玉米中甘蔗花叶病毒的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包 括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合 酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 还包括标准阳性模板。

5.玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法，其特征在于，利用权利要 求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒对玉米中甘蔗花叶 病毒进行RT-PCR以及Real-timePCR检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取玉米叶片中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链，以 cDNA链为模板进行PCR扩增反应；

2)以步骤1)中的cDNA链为模板，进行Real-timePCR扩增反应；

3)分析RT-PCR和Real-timePCR扩增产物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：

①在经DEPC处理的离心管中配制RNA/引物混合物体系6μl： 700ng/μlRNA1μl，50mΜOligO(dT)-18Primer0.2μg，DEPC-H₂O补 足至6μl，70℃保温10min，冰上冷却2min，然后瞬时离心，使溶液聚 于管底；

②向管中加入以下成分，配制反转录缓冲液：5×M-MLV酶反应 缓冲液10μl，2μM正向引物F0.5μl，2μM反向引物R0.5μl，M-MLV反 转录酶1μl，DEPC-H₂O17.5μl，混匀后瞬时离心，42℃保温60min；

③PCR扩增反应

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃45s，共30 个循环；72℃10min。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，采用SYBRGreen I嵌合荧光法进行RealTimePCR，反应体系以25μl计为：

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，RealTimePCR 反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。