[发明专利]一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法。 

背景技术

末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一种特殊的DNA聚合酶。TdT可不依赖模板，催化脱氧核苷三磷酸(dNTP)，逐个聚合至单链或双链DNA片段的3’-OH端上。该酶特异分布于哺乳类动物的胸腺、骨髓及某些类型的白血病患者的恶性细胞中，通过测定其活性，可用于白血病的诊断及预后。（Rudzka E et al., Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch. 1985;112(6):864-71）(Hutton JJ et al., Blood. 1982 Dec;60(6):1267-76.)。因此，测定体内的TdT活性具有十分重要的临床诊断价值。 

TdT也是基因工程技术以及生命科学研究中一种重要的工具酶。在细胞凋亡的过程中，染色体的DNA被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180-200bp的整倍数的片段，产生游离的3’-OH末端。TdT可在这些末端上掺入荧光标记的dUTP，因此可在荧光显微镜下直接观察到凋亡细胞。这种被称为TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)的方法是目前原位检测细胞凋亡最重要、最准确的方法，而TdT酶是TUNEL实验中的核心。目前商品化的TUNEL试剂盒中通常采用的是基因工程重组表达的TdT酶，其质量、活性决定了TUNEL结果的好坏。如果一个反应中加入的TdT酶活性过高，会导致非特异性染色；而加入的TdT酶活性过低则会导致染色失败。因此，准确测定重组TdT酶的活性，保证批次活性的稳定性，对于TUNEL试剂盒的质量具有至关重要的意义。 

经典的TdT酶活力测定法采用放射性底物掺入法，即采用以³²P标记的dATP为底物，经TdT催化使其掺入到oligo (dA)₂₅上，其反应式如下： 

n[α-³²p]-dATP + oligo (dA)₂₅             oligo (dA)₂₅([α-³²p]-dAMP)n + nppi

通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出TdT酶的活性。这种方法灵敏度虽高，但受标记物质量所限，且操作过程繁琐，易产生放射性污染。

张华等（生物化学与生物物理进展，1990,17:387-389）将放射性底物[α-³²p]-dATP替换为荧光标记底物εdATP，经TdT催化使其掺入到oligo (dA)₂₅上，其反应式如下： 

n εdATP + oligo (dA)₂₅          oligo (dA)₂₅(εdAMP)n + nppi

通过测定酸不溶性产物的荧光强度，计算出TdT酶的活性。这种方法无需放射性同位素操作，但其荧光标记底物εdATP无商品化试剂，需要实验者自行合成，合成难度大、周期长，质量难以控制；此外反应产物需要经过蛇毒磷酸二酯酶水解，才能测定荧光强度，操作步骤的繁琐程度更甚于放射性同位素法。

目前，以上述两种方法为代表性的TdT测活方法本质上还是通过测定掺入的标记dATP的量来计算酶活，这些方法可以统称为“掺入法”。“掺入法”的关键在于掺入产物和标记dATP（放射性同位素或荧光标记）的分离。三氯乙酸TCA可使oligo (dA)₂₅沉淀，而标记的dATP不被沉淀；将TCA处理的产物加在whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记dATP的分离。再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定放射性同位素或者荧光强度。因此，所有基于“掺入法”的测活方法，都存在步骤多、周期长的缺陷，难以实现高通量、自动化。 

发明内容

本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的TdT酶测活方法。本发明采用了一种全新的“转化法”替代传统的“掺入法”，其原理如图1所示。 

具体来说，本发明的技术方案如下：