[发明专利]载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒

说明书

技术领域

本发明属于医药制剂领域，涉及载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒及其制备方法。

背景技术

天门冬酰胺酶用于治疗白血病及一些恶性淋巴肿瘤已有近40年时间，特别是治疗急性淋巴细胞性白血病等恶性血液病的重要药物。天门冬酰胺酶可通过降解天冬酰胺的酰胺键而生产天冬氨酸和氨，从而抑制肿瘤细胞代谢过程中蛋白质的正常合成，干扰肿瘤细胞生长而最终导致肿瘤细胞的死亡。但天门冬酰胺酶具有体内活性半衰期短、稳定性差、生物利用度低、易被酶降解及副作用多等缺点，制约了天门冬酰胺酶的临床推广使用。为改善上述问题，本发明将自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒作为天门冬酰胺酶的载体，以延长天门冬酰胺酶的体内活性半衰期，提高其稳定性、生物利用度，并且降低其副作用。载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒为天门冬酰胺酶提供了一种可供选择的新型递送系统，具有重要意义。

经查询专利及文献，目前尚无聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的任何研究报道。目前尚无载带任何药物(酶、小分子药物、基因等)的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的任何研究报道。当然，目前也尚无载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的任何研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒及其制备方法。载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒具有体内活性半衰期长、稳定性好、生物利用度高的优点。本发明制备得到的载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒极大地克服了天门冬酰胺酶体内活性半衰期短、稳定性差、生物利用度低、易被酶降解及副作用多等缺点，为天门冬酰胺酶提供了一种可供选择的新型递送系统，具有明显的实用意义，社会和经济价值。

本发明提供的载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒，其特征在于制剂中各组分重量百分比为：天门冬酰胺酶0.04-0.5份，聚乙二醇-透明质酸0.1-2份，环糊精6-24份，水相(1)(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)50-150份，水相(2)(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)150-400份。环糊精是指羟丙基-β-环糊精，α-环糊精，γ-环糊精，二甲基-β-环糊精，磺丁基醚-β-环糊精的一种或几种。聚乙二醇-透明质酸是由分子量为2000的甲氧基聚乙二醇和分子量为6000-80000的透明质酸以摩尔比为1∶1合成制得，红外图谱表明已合成聚乙二醇-透明质酸(图1)，合成方法包括下列步骤：称取甲氧基聚乙二醇、N-叔丁氧羰基甘氨酸溶于二氯甲烷，加入催化剂4-(二甲胺基)吡啶和脱水剂二环己基碳二亚胺，磁力搅拌后过滤，滤液于室温下旋转蒸发或真空干燥至得到含颗粒的油溶液。将其溶于丙酮，放置后过滤，旋转蒸发滤液至得固体产物(1)，将固体产物(1)于室温下真空干燥。取干燥产物溶于体积比为1∶1的二氯甲烷/三氟乙酸混合溶液，搅拌后旋转蒸发至油溶液。将油溶液溶于氯化钠溶液，调节pH至5，过滤，氯仿萃取滤液，合并有机相，用吸水剂无水硫酸钠干燥有机相，过滤，旋转蒸发滤液至油溶液，真空干燥油溶液得到固体产物(2)，将固体产物(2)溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液。另称取透明质酸溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，加入羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐(溶液中1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐∶羟基琥珀酰亚胺∶透明质酸中含有羧酸根COO^-的摩尔比＝1∶0.5∶1，mol∶mol∶mol)，磁力搅拌下缓慢滴加入上述溶有固体产物的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液，搅拌均匀后将上述溶液置于透析袋中，蒸馏水透析后，旋转蒸发溶液至固体，用丙酮和氯仿分别冲洗，真空干燥，即得聚乙二醇-透明质酸(图1)。本发明提供的载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒，以自组装的形式制备，步骤如下称取聚乙二醇-透明质酸，加入水相(1)充分溶解，将天门冬酰胺酶加入上述溶液，使其充分溶解，即得含天门冬酰胺酶的聚乙二醇-透明质酸溶液，另称取环糊精，加入水相(2)使其充分溶解，磁力搅拌下缓慢滴加入含天门冬酰胺酶的聚乙二醇-透明质酸溶液，磁力搅拌一定时间，即得载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒。用本发明制得的载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的热稳定性与天门冬酰胺酶的热稳定性比较，载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒表现出了很好的热稳定性(图2)。载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的抗胰蛋白酶水解与天门冬酰胺酶的抗胰蛋白酶水解比较，自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒的抗胰蛋白酶水解能力明显优于天门冬酰胺酶，自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒能很好地保护天门冬酰胺酶，以避免受体内胰蛋白酶的破坏(图3)。大鼠尾静脉注射本发明制得的载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/羟丙基-β-环糊精纳米粒后体内药动学考察结果表明，相对于天门冬酰胺酶，载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/羟丙基-β-环糊精纳米粒的体内清除率降低，药时曲线下面积增大，峰浓度Cmax增大，半衰期延长，载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/羟丙基-β-环糊精纳米粒在体内的生物利用度明显增加到天门冬酰胺酶的3.5倍(图4)。大鼠尾静脉注射给药载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/羟丙基-β-环糊精纳米粒或天门冬酰胺酶，给药剂量均为2.0kU/kg(以天门冬酰胺酶计)。分别于给药后不同时间眼眶后静脉丛取血，置于肝素化试管中，混匀，6000rpm离心5min，分离上层血浆，于-20℃冰箱中保存备用。血浆样品活性测定方法为：用移液管向数支离心管内各滴入0.2mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液和1.7mL天冬酰胺溶液，置于水浴中调温至37℃。加0.10mL血浆样品后精确保温10min。加0.10mL三氯醋酸溶液，反应终止。离心分离上述试液，取出0.50mL上清液滴入7.0mL蒸馏水中，再加1.0mL奈斯勒指示剂。室温下静置10min后用分光光度计(480nm)以空白为参比测定吸光度，结果代入回归方程计算活性，得到药时曲线，见图4。