[发明专利]一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及诊断研究领域，特别涉及一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种传染性很强、致死率极高的热性传染病。能够引起热性全身性败血症、母猪流产、胎儿畸形等多种临床表现，从而给养猪业带来严重的危害，世界兽医局将其列为A类16种法定传染病之一。时至今日，猪瘟仍然是我国养猪业的第一大传染病。随着诊断技术和防疫的进步，世界上猪瘟的发生已经呈减少的趋势，猪瘟疫苗的使用时间及使用效果也影响的猪瘟病毒的危害性，因此检验疫苗的效果和决定疫苗使用的时间必将成为有效控制猪瘟病毒蔓延的有效措施之一。

体外诊断核心原料的开发则是开发相应诊断试剂的先决条件，只有开发出具有高活性，高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实，因此，针对猪瘟病毒抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉捷，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低猪瘟病毒感染首要解决的问题。

目前大多生产原料公司在猪瘟病毒抗体诊断产品有选取猪瘟病毒E2的部分片段或者对选取的片段进行重组等，准确率不高，尤其以假阴现象较多。

发明内容

本发明针对上述缺点，提供了一种可用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，目的是针对猪瘟病毒E2整体进行重组表达，以期用此抗原作为检测猪瘟病毒抗体的核心原料，避免假阴性的漏检现象。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

本发明提供一种用于检测猪瘟病毒的重组抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤a，基因合成，设计引物进行PCR反应，得到猪瘟病毒的E2基因序列如SEQ ID No：1所示；

步骤b，构建重组表达载体，步骤a中的基因序列测序成功后，将该基因序列用限制性内切酶进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的质粒表达载体中；

步骤c，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，将步骤b中的重组表达质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达，诱导之后，收集菌体；

步骤d，合有猪瘟病毒E2重组蛋白的纯化及复性，将步骤c收集的菌体破碎提取重组蛋白，然后进行纯化及复性，得到重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID No：28所示。

进一步，步骤a中，设计引物如下：

CSFV-1u：

ATGCAGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATA

CSFV-1d：

ATTCTTTCCAGGTGGTGGTGAGACCTCCGGCCCCGAGTAGCCCTATCTCATTGGTTGA

CSFV-2u：

CCACCTGGAAAGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATT

CSFV-2d：

TGACCACATTAAGTGCTGTGACTTTAAAGGAACCTGCCACGCAAATGGCCTTAACGGT

CSFV-3u：

CACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGAGGCTTCACTCACT

CSFV-3d：

GAGGCTTCACTCACTTCCGTGACATTTGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAAC

CSFV-4u：

CAAATGGGCACAGCCCGAACCCGAAGTCATCTCCCATTTCCTCAGTTGATGGGTTGGTC

CSFV-4d：

CAAGGTTGTGTTGTACTTTCCCTTGACAACAGGACTCGTATCAAATGGGCACAGCC

CSFV-5u：

TACAACACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTACTATCTTGTCTGTCCAATAGGGTGGAC

CSFV-5d：

TTCTCAGAGTTGTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTATAACACCCGTCCACCCTATTGGA

CSFV-6u：

CAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGGGACAAGCCCTTTCCGCAC

CSFV-6d：