[发明专利]一种用于蛋白质分离的WCX/HIC双功能混合模式聚合物基质色谱固定相及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相，具体地说是一种疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相。

背景技术

生物技术和生命科学的发展，尤其是重组蛋白质药物的生产和蛋白质组学的研究都依赖于蛋白质高效快速的分离技术。液相色谱(LC)是蛋白分离纯化最有效的工具，二维液相色谱(2DLC)已成为蛋白质组学研究的关键技术。而液相色谱的核心——色谱柱及其色谱固定相，历来都是色谱技术发展的动力来源。

目前一根传统的色谱柱均是基于一种分离机理，如静电作用、疏水作用、亲合作用等，只能用单一分离模式对蛋白质进行分离纯化，其特征是“一柱一用”。混合机理色谱(mixed-mode chromatography, MMC) 是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的色谱模式。在合成MMC色谱填料时，在配基中合理地引入多个作用位点，使固定相和蛋白质之间存在多种相互作用，以提高固定相的选择性和柱效。与传统的单一模式色谱相比，具有许多优点，如分离效果好，选择性高和柱负荷高等，从而成为当今液相色谱研究的热点之一。目前已报道的MMC主要有RPLC/IEC、亲水色谱(HILIC)/ IEC、HIC/IEC、RPLC/HILIC、疏水性电荷诱导色谱(hydrophobic charge induction chromatography，HCIC)等几种类型。

Kennedy[Kennedy L A, et al, J Chromatogr A, 1986, 359: 73-84]等合成了一种弱阴离子交换填料，该填料具有一定的疏水相互作用性质。Horvath等[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469: 3-27]]曾合成了一种聚合物基质的混合模式弱阴离子交换分离介质。目前IEC/HIC MMC色谱柱已有商品化，如美国GE Healthcare公司的Capto MMC and Capto adhere，Pall Life Sciences 公司设计生产的HEA, PPA and MEP HyperCel耐盐层析介质，然而，这些 MMC 柱均是以一种色谱分离模式为主，而伴随的其他模式只起着强化主分离模式的辅助作用，不能有效地用于蛋白质样品的二维分离，因此不能称之为二维色谱填料。

以硅胶为基质的色谱固定相pH 适用范围为2-8，这就限制了其在较低或较高pH条件下的使用。与硅胶基质相比，高分子聚合物具有良好的化学稳定性，样品负载量大，可在pH1-14内使用。

传统化学方法制备的键合固定相经常以有机溶剂为介质，而且还会包括很多副反应，这会导致生成的固定相表面配基不均匀、键合量低，还会使成本上升以及环境污染。2001年，K.Barry Sharpless研究小组提出了一种高效、高选择性的合成新策略，并将其命名为“Click chemistry”（点击化学）[Kolb H. C., et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2001, 40: 2004-2021]。“点击化学”的核心思想是利用一系列可靠、高效、高选择性的化学反应来实现碳杂原子的链接（C-X-C），以合成含杂原子的有机化合物，其中应用最成功的是一价铜催化的端基炔和有机叠氮化物反应生成三唑的1,3偶极环加成反应。此类反应的特点为：①反应原料易得；②反应操作简单，条件温和；③反应选择性高，副反应少，产率高，有时产率甚至可达100％；④反应后产物易于处理、纯化。基于以上优点，点击化学已经被广泛应用于有机合成、高分子合成、药物合成与筛选、材料合成和生物大分子修饰等领域。

尽管Cu(I)催化的端基炔和有机叠氮化物反应得到了广泛的应用，但由于反应中要使用一价铜为催化剂，使得生成的固定相中难免会有重金属残留。有报道称由于催化剂Cu(I)的存在诱导了病毒或寡核苷酸的降解[Wang Q, et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:3192-3193; Gierlich J, et al., Org. Lett. , 2006, 8:3639-3642]，这将在很大程度上限制该反应在生物材料及药物载体等方面的应用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型疏水/弱阳离子交换混合模式色谱固定相，以满足分别在离子交换模式和疏水模式下实现对蛋白质的高效分离的要求，实现“一柱二用”的功能。