[发明专利]一种临床用间充质干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种临床用间充质干细胞的制备方法。

背景技术

干细胞(Stem Cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括脐带、脐带血与骨髓。

婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤(如：急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等)、血红蛋白病(如：海洋性贫血)、骨髓造血功能衰竭(如：再生障碍性贫血)、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤(如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营养不良等)。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医疗费用低。

在人脐带中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(MSCs)。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。

目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。

中国发明专利ZL200610067537.5公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法，其步骤包括诸如：将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用筛网过滤，去除未消化组织；将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；离心；以及将细胞接种于培养基内进行培养等。

中国发明专利申请200910194915.X公开了一种脐带血间充质干细胞及其制备方法，分离并获取了具有成骨分化潜能的UCB-MSCs细胞亚群的干细胞。其技术手段主要涉及将来自脐血的间充质干细胞的单细胞悬液和荧光标记的CD105单克隆抗体混合后，通过流式细胞仪分选得到CD105阳性(CD105+)的脐带血间充质干细胞。该干细胞接种于医学上可接受的生物可降解材料，形成了骨移植物。

但目前公开的各类间充质干细胞制备方法虽均能获得间充质干细胞，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现间充质干细胞的临床标准产品。

发明内容

针对现有技术缺陷，本发明提供一种临床用间充质干细胞的制备方法，本发明制备方法在脐带采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。

本发明提供一种临床用间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；

步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm³小块；