[发明专利]一种临床用间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；

步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm³小块；

步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；

步骤四、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为6000个/cm²；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3～5×10⁹，收集细胞并计数和活率，按2×10⁷/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×10⁷细胞做细胞表面标志检测；

步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：按照ISCT间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；

步骤六、临床用间干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。

2.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述脐带保存液为无血清培养基，不含抗生素。

3.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。

4.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述胰蛋白酶的浓度为0.05％，由0.25％成品胰酶稀释5倍。

5.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10％；谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。

6.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。

7.根据权利要求1所述的临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10％。