[发明专利]一种重组菌丝霉素及其表达纯化的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组菌丝霉素及其表达纯化方法和应用。

背景技术

随着抗生素在临床上的广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，增加了疾病治愈的难度并且给患者和社会带来了严重的经济负担。特别是近年来“超级细菌”逐渐增多，使得在合理用药的同时研发新一代安全高效的抗菌制剂显得尤为迫切。

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点。迄今为止，研究者已经从细菌、真菌、两栖类、昆虫、植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得了具有抗菌活性的多肽。由于这些多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides, ABP”。并随着研究工作的深入，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有杀伤作用。

Plectasin也称为菌丝霉素，是在腐生子囊菌Pseudoplectania nigrella中发现的新型抗菌肽。体外抑菌试验表明，Plectasin对于多种G+细菌具有很高的杀菌活性。进一步体内抑菌试验表明，在肺炎链球菌感染小鼠引起的腹膜炎和肺炎模型中，Plectasin的疗效分别与万古霉素和青霉素相当。Shintaro Harat等人实验证明Plectasin对人类支气管上皮细胞、齿槽上皮细胞和肺纤维原细胞没有毒性，不会影响他们的增殖，而且不会诱导炎症因子IL-8的转录和表达。此外，Plectasin具有选择性杀灭作用，安全性高。Plectasin与细菌细胞壁形成的前体物质Lipid Ⅱ具有很强的亲和性，可以通过与Lipid Ⅱ结合阻止病菌细胞壁的形成，从而阻止病菌繁殖。Plectasin独特的作用机制不易诱导产生耐药性菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素。

本发明的另一目的在于提供一种重组菌丝霉素的表达纯化方法。

本发明的再一目的在于提供上述重组菌丝霉素的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种菌丝霉素，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

一种重组菌丝霉素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，其为含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的pE-SUMO重组载体。

一种重组菌，其含有上述所述的重组载体。

一种重组菌丝霉素的表达和纯化的方法，包括以下步骤：

1）取上述所述的重组菌，增殖培养，诱导表达培养，离心，得菌体；

2）取步骤1）所得菌体，裂解，离心，得裂解上清液；

3）将上述上清液进行使用Ni-NTA亲和层析纯化，即得重组菌丝霉素。

进一步的，上述步骤1）中，所述重组菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)，培养基为LB 培养基，增殖培养的条件是37℃、180 r/min 振荡培养至OD600为0.5。

进一步的，上述步骤1）中所述诱导表达培养的条件是30℃、180 r/min 振荡培养6h，使用的诱导剂是浓度为0.05mM的IPTG。

进一步的，上述步骤2）中所述裂解为冰浴超声破碎，破碎条件为工作时间5s，间歇时间5s，功率400W，工作时间20min。

进一步的，上述步骤3）中所述纯化的具体步骤为：每5mL Ni-NTA树脂用50ml NTA20平衡后，与上清液混合，4 ℃摇动结合1 h后；再将Ni-NTA树脂装入层析柱，流速为2mL/min；使用pH 7.4磷酸盐缓冲液以流速2 mL/min洗涤；用咪唑浓度为500mmol/L的含0.1%Tween20的 pH7.4磷酸钠洗脱液洗脱，FPLC自动收集洗脱液。

一种菌丝霉素的表达和纯化的方法，将上述获得的重组菌丝霉素经酶SUMOpro酶切，透析，即可，所述透析用截留分子量为3kDa的透析袋进行透析。

本发明的有益效果是：

本发明的制备了一种新的重组菌丝霉素，小泛素相关修饰物（SUMO）有利于蛋白质中巯基的形成，有利于菌丝霉素发挥其抑菌杀菌的生物学功能。而且SUMO化的蛋白质不像泛素化的蛋白质那样容易被蛋白酶体水解，反而更加稳定。

本发明通过对重组菌丝霉素的表达纯化方法的优化，可大量获得高纯度、高活性的菌丝霉素，其抑菌效果佳，抗菌范围广泛，抗菌谱大。

附图说明

图1为 PCR鉴定pE-SUMO-Plectasin结果；M：DNA分子量标准；1：重组质粒pE-SUMO-Plectasin PCR鉴定结果；