[发明专利]一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于免疫学检测方法领域，目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法，该方法包括DIBO标记ssDNA的合成、Insulin单克隆抗体的生物素修饰、Insulin单克隆抗体的ssDNA修饰Immuno‑PCR微孔板的制备、Insulin的Immuno‑PCR标准曲线的制定等步骤。本发明通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超低浓度生物素标志物的检测，可以超过传统ELISA方法1000倍的灵敏度可以允许检测浓度极低的生物标志物。

技术领域

本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

ELISA检测技术从其发明之日起就在临床和科研市场中得到越来越广泛的应用(Lequin,R.M.(2005).Enzyme Immunoassay(EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA).Clinical Chemistry 51,2415–2418.)。随着越来越精细的检测需求，终端用户在体外诊断的灵敏度、动态范围和多通道检测能力等方面有了越来越高的要求。基于抗体检测的技术也越来越多样化，出现了很多新技术。根据技术路线和需求的不同分为以下几类：

1.灵敏度的提升。经过多年的技术升级和成熟，目前ELISA技术的灵敏度已经达到极限。现有的尝试也都是基于检测方法的改进来提升灵敏度，比如采用创新型微孔板技术的Siloam Biosciences公司(http://siloambio.com/)和应用微珠技术的Quanterix公司(http://www.quanterix.com/)。

2.多通道检测。Luminex公司发明的像xMAP Multiplexing技术理论上可以最多支持500种分析物的同时检测(http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/)。这种技术也是利用barcode的微珠标记上不同抗体来检测样本中的多种分析物。实际开发中可以达到20种左右的生物标志物同时检测。

3.液相ELISA技术(Bidinosti,M.,Shimshek,D.R.,Mollenhauer,B.,Marcellin,D.,Schweizer,T.,Lotz,G.P.,Schlossmacher,M.G.,and Weiss,A.(2012).Novel one-step immunoassays to quantify á-synuclein:applications for biomarkerdevelopment and high-throughput screening.J.Biol.Chem.287,33691–33705.)。

将检测抗原的两种单抗分别标记不同的微珠或者荧光基团，利用抗体和抗原结合时将两种不同的微珠靠近或者荧光基团发生共振能量转移(FRET)可以实现被检标志物的液相检测。这种检测方法不再需要多步清洗而直接检测，减少了检测时间和自动化的难度。

4.ELISA技术微型化(Ng,A.H.C.,Uddayasankar,U.,and Wheeler,A.R.(2010).Immunoassays in microfluidic systems.Anal Bioanal Chem 397,991–1007.)。很多研究将ELISA微型化至微流体芯片上从而实现ELISA实验的微型化和便携性。