[发明专利]一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的试剂盒，其特征在于：所述检测胰岛素的试剂盒包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体胰岛素单克隆抗体8E2、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体胰岛素单克隆抗体3A6的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光定量染料混合体系；

其中，

所述核酸为ssDNA；所述ssDNA的DNA序列包括SEQ ID No.1，用于扩增所述ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

2.根据权利要求1所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离子、dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。

3.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

DIBO标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列SEQ IDNo.1，再合成带DIBO标记的ssDNA；

捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIBO标记的生物素进行生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；

检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIBO标记的ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体；

Immuno-PCR微孔板的制备步骤：

用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；

待测样品的Immuno-PCR定量步骤：

将待测样品和所述带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体混合之后，加入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3进行荧光定量PCR反应，再完成ssDNA的PCR定量；所述捕捉抗体为Insulin单克隆抗体3A6，所述检测抗体为Insulin单克隆抗体8E2，所述待测样品为Insulin。

4.根据权利要求3所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的方法，其特征在于：所述捕捉抗体的生物素修饰步骤中，先将所述捕捉抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的捕捉抗体；再将所述第二轮纯化后的捕捉抗体与于DIBO标记的生物素进行生物素标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体。

5.根据权利要求3所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的方法，其特征在于：所述检测抗体的ssDNA修饰步骤中，先将所述检测抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的检测抗体；再将所述第二轮纯化后的检测抗体与于DIBO标记的ssDNA进行ssDNA标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体。

6.根据权利要求3所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测胰岛素的方法，其特征在于：所述待测样品的Immuno-PCR定量步骤中，所述荧光定量PCR反应的条件是：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环。