[发明专利]一种新的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因微生物检测技术领域，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条技术相结合的快速检测转基因枯草芽孢杆菌的试剂盒，适用于转基因枯草芽孢杆菌的快速检测。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，是细菌中的一个常见种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。

目前在酶制剂产品中的转基因微生物检测的技术还是主要依靠传统分离培养的形态学检测方法，检测灵敏度低，而且检测周期需要几天时间。近些年来，随着分子生物学检测技术的快速发展，PCR技术成了微生物快速检测的常用手段，但是扩增产物需要凝胶电泳，紫外凝胶成像，步骤多，耗时长，而且存在核酸染色剂环境污染的问题。

本研究通过巧妙地设计针对转基因枯草芽孢杆菌的带标记的特异性引物和探针，应用PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因枯草芽孢杆菌的高效快速准确检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于转基因枯草芽孢杆菌检测的准确性、检测效率的提高具有重要的作用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供用于检测转基因枯草芽孢杆菌的两套特异性引物和探针。

本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的核酸试纸条检测试剂盒。

本发明用于检测转基因枯草芽孢杆菌的两套PCR引物及探针序列为：

上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’ 

下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’

探针1：Spo-p-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’

上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’ 

下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’

探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’。

 

   本发明的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒，包括以下成分：

（1）转基因枯草芽孢杆菌DNA模板和阴性对照野生型枯草芽孢杆菌DNA模板

（2）转基因枯草芽孢杆菌带标记的上、下游引物和探针

上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’ 

下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’

探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’

上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’ 

下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’

探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’

（3）10×Taq PCR Buffer ,DDH₂O,2.5mM dNTP ,5U/μl Taq酶

   分别用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增、探针杂交，产物用试纸条检测，如果两套引物探针的检测结果显示，控制线正常、检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因枯草芽孢杆菌，若有一套引物探针或两套引物探针检测线呈现阴性，则说明该样品中不含有转基因枯草芽孢杆菌。

   与现有技术相比，本发明的进步在于：无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而大幅降低检测仪器投入，检测速度明显优于凝胶电泳成像，而且该检测方法特异性强，灵敏度高，稳定性好。

 

附图说明

图1为Spo试纸条特异性检测，图2为NprE试纸条特异性检测，1为转基因枯草芽孢杆菌，2、3、4、5、6、7为野生型枯草芽孢杆菌，8为DDH₂O，从图1、图2 可以看出使用本试剂盒能准确地检测出转基因枯草芽孢杆菌。

 

具体实施方式

第一套Spo特异引物探针设计(下划线位置):