[发明专利]一种新的转基因枯草芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.两套用于转基因枯草芽孢杆菌检测的特异性引物和探针，其特征在于，序列为：

上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’ 

下游引物1： Spo-R：5’— ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’

探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’

上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’ 

下游引物2： NprE-R：5’— TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’

探针2：NprE-P-fitc： 5’ fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’。

2.一种用于检测转基因枯草芽孢杆菌的试剂盒其特征在于，包括如下成分：

（1）阳性对照转基因枯草芽孢杆菌DNA模板和阴性对照野生型枯草芽孢杆菌DNA模板

（2）转基因枯草芽孢杆菌Spo、NprE特异序列上下游特异引物和探针

上游引物1： Spo-F-bio：5’biotin —CTGCATCGGGCTGGAAAATGAC—3’ 

下游引物1： Spo-R：5’—ATCCCCAGTCCCAAACCGATGC—3’

探针1：Spo-P-fitc： 5’ fitc—AACCTGCACCTGAGAGATCC—3’

上游引物2： NprE-F-bio：5’biotin—CTGGGAAGTCTCGACGGT—3’ 

下游引物2： NprE-R：5’—TAATTCTGGATGCCGAAAGC—3’

探针2：NprE-P-fitc： 5’fitc—AATACCCGAATACGTCAGAG—3’

（3）10×Taq PCR Buffer ,ddH2O ,2.5mM dNTP ,5U/μl Taq酶

（4）生物素（Biotin）、荧光素（Fitc）抗原标记的薄膜层析试纸条。

3.一种转基因枯草芽孢杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）PCR反应体系：      

10×Taq Buffer                       2.5μl

dNTP（2.5mmol/L）                 1μl

上游引物（10μmol/L）            1μl

下游引物（10μmol/L）            1μl

模板DNA                                  1μl

Taq酶(5U/μl)                       0.25μl

ddH2O                                  18.25μl 

总体积：                                25μl

PCR反应条件：94 ℃ 预变性 1 min，94 ℃变性30 s，60.8 ℃ ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min

（2）探针杂交：扩增结束后，加入探针（10μmol/L） 2 μl，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s

（3）取4 μL扩增、杂交产物加到试纸条的样品垫上，然后滴加2-3滴缓冲液，5 min后判读并记录结果

（4）判定结果：用Spo、NprE两套特异引物探针进行扩增、杂交，PCR 产物用试纸条检测，两套引物、探针控制线正常，检测线都呈现阳性时，则说明该样品含有转基因枯草芽孢杆菌，若有一套或两套引物、探针试纸条检测结果显示为阴性，则判定样品中没有转基因枯草芽孢杆菌。