[发明专利]重组酰胺酶Dt‑Ami2、编码基因、载体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种酰胺酶及应用，特别涉及一种重组酰胺酶Dt-Ami 2、编码基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该酰胺酶或含有该酶的重组细胞为催化剂在在催化一系列酰胺中的应用。

(二)背景技术

酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)能够催化酰胺C-N键水解生成相应的羧酸和氨。当反应体系中存在比水更强的酰基受体如羟胺或肼时，则生成相应的氧肟酸和酰肼。酰胺酶底物范围广，对α位含手性中心的底物具有优良的立体选择性，在制备羧酸和酰胺衍生物等手性化合物中具有巨大应用潜力。酰胺酶已成功用于多个手性药物中间体如(S)-哌嗪-2-甲酸(US5945534)，(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(US7553652)和(S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺(ZL200510061680)的工业化生产。

根据氨基酸序列特征，酰胺酶可分为酰胺酶标签家族(Amidase Signature Family,AS)和腈水解酶家族(Nitrilase Family，NF)两大类。AS家族酰胺酶的氨基酸序列含有130个左右高度保守氨基酸区域，并含有催化三联体Lys-Ser-Ser，作用底物范围较广，可水解脂肪族、芳香族及杂环类酰胺，如来自Stenotrophomonas maltophilia和Rattus norvegicus的酰胺酶。NF家族酰胺酶同源性很高，并含有Lys-Ser-Glu催化三联体，通常水解脂肪族酰胺，如来自Pseudomonas aeruginosa，Bacillus stearothermophilu和Rhodococcus erythropolis酰胺酶。

生物催化剂的多样性是生物催化反应多样性的前提和基础。但是，目前已报道的酰胺酶十分有限，这极大限制了酰胺酶在生物合成中的应用。因此，挖掘和筛选底物谱广、立体选择性严格的酰胺酶具有十分重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种来源于代尔夫特菌Delftia tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶Dt-Ami 2基因及其重组酰胺酶Dt-Ami 2，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，该重组酶Dt-Ami 2的制备方法及该酰胺酶Dt-Ami 2的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174的重组酰胺酶Dt-Ami 2，所述酰胺酶Dt-Ami 2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明所述酰胺酶Dt-Ami 2通过基因挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为根据AS家族及NF家族酰胺酶保守序列，有针对性地寻找NCBI收录的基因编码的氨基酸序列，进一步筛选可匹配催化三联体的蛋白。选定一批预测的酰胺酶，将所选的酰胺酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过本实验室发明的方法(ZL200510062182)进行酰胺酶活力的筛选，最终获得催化性能较佳的重组酰胺酶Dt-Ami 2。

本发明所述重组酰胺酶Dt-Ami 2来源于代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis)ZJB-05174，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 205114，保藏日期为2005年10月10日，已在先前的专利申请(申请号为CN 2005100616809)中披露。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。