[发明专利]一种荧光探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种荧光探针的制备方法。

背景技术

壳聚糖为聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖,是甲壳素部分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖。它是天然多糖中唯一的碱性多糖,具有良好的生物相容性和生物降解性能。其弱酸水溶液具有高粘性,带正电荷。可与带负电荷高聚物发生交联反应而形成微球。壳聚糖链中的伯胺基团很容易和生物分子发生反应,诸如:蛋白质、DNA、酶、抗原抗体、生物素以及荧光分子异硫氰酸酯(FITC)等。壳聚糖微球已应用于亲和色谱介质及酶的固定化。因此壳聚糖纳米微球极有可能成为同时偶联荧光分子和生物识别分子的良好基质。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供一种制备简单,良好的生物相容性的荧光探针的制备方法。

为实现上述目的，本发明包括以下步骤。

1)5g壳聚糖溶解在醋酸溶液中,逐滴加入H₂O₂溶液,在水浴中降解；每隔数小时,取溶液,用NaOH溶液沉淀,用去离子水洗至中性,真空干燥备用。

2）用乙酸、NaCl溶液为溶剂,测定,求出特性粘度数后,计算壳聚糖的粘均Mr。

3）称取经不同时间降解的壳聚糖,溶解于醋酸溶液,壳聚糖浓度为0.5%(m/V)；用NaOH调pH=4.6-4.7；取上述壳聚糖的醋酸溶液,逐滴加入TPP溶液,磁力搅拌,得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液。

4）高速离心CS纳米粒子,将上层清液倒掉,冲洗微球,备用；将离心后的CS纳米粒子分散在醋酸溶液中,壳聚糖的浓度为1g/L;加入FITC无水二甲基亚砜溶液,壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3mL：0.3mL；用锡箔包住反应试管,避光反应3h,得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针。

5）离心,洗涤,用紫外分光光度计在480nm检测离心上清液,直至在此波长下无吸收。

作为一种优选方案，本发明所述步骤1)5g壳聚糖溶解在150mL3%的醋酸溶液中,逐滴加入50mL6%H₂O₂溶液,在水浴中降解；每隔数小时,取50mL溶液,用10mol/L的NaOH溶液沉淀,用去离子水洗至中性,真空干燥备用。

2）用0.1mol/L乙酸0.2mol/LNaCl溶液为溶剂,在25度下测定,求出特性粘度数后,计算壳聚糖的粘均Mr。

3）称取经不同时间降解的壳聚糖,溶解于1%(V/V)的醋酸溶液,壳聚糖浓度为0.5%(m/V)；用10mol/LNaOH调pH=4.6-4.7；取10mL上述壳聚糖的醋酸溶液,逐滴加入3mL0.25%(m/V)TPP溶液,磁力搅拌,得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液。

作为另一种优选方案，本发明所述步骤4）以12000r/min高速离心CS纳米粒子10min,将上层清液倒掉,冲洗微球,备用；将离心后的CS纳米粒子分散在1%(V/V)醋酸溶液中,壳聚糖的浓度为1g/L;加入10g/L的FITC无水二甲基亚砜(DMSO)溶液,壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3mL：0.3mL；用锡箔包住反应试管,避光反应3h,得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针。

5）离心,洗涤,用紫外分光光度计在480nm检测离心上清液,直至在此波长下无吸收。

本发明有益效果。

本实验通过控制低分子量壳聚糖聚阳离子与三聚磷酸钠阴离子之间的比例制备了粒度均一壳聚糖纳米粒子,利用壳聚糖上的氨基在酸性条件下和FITC中的异硫氰酸根(NCS)反应,制得FITC标记的壳聚糖纳米粒子。该探针具有制备简单,良好的生物相容性,粒径均匀有规则以及对光稳定的优点。此外该粒子表面的残余氨基可进一步与生物分子偶联,制备成能识别特定生物分子的纳米荧光探针,因而有望用于生物与医学分析领域。

具体实施方式

本发明包括以下步骤。

1)5g壳聚糖溶解在醋酸溶液中,逐滴加入H₂O₂溶液,在水浴中降解；每隔数小时,取溶液,用NaOH溶液沉淀,用去离子水洗至中性,真空干燥备用。

2）用乙酸、NaCl溶液为溶剂,测定,求出特性粘度数后,计算壳聚糖的粘均Mr。