[发明专利]一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般由两个天冬氨酸残基组成，目前主要包括胃蛋白酶、凝乳酶、溶酶体酶等。天冬氨酸蛋白酶抑制剂可增强免疫力、抗癌及降压，对老年痴呆及胃溃疡等患者也具有显著的疗效，目前在食品保健及医药行业中应用十分广泛。但目前化学合成天冬氨酸蛋白酶抑制剂安全性得不到保证，如沙奎那韦可引起脂质代谢紊乱，因此，其实际应用受到明显限制。

云芝(Coriolusversicolor)又称为采绒革盖菌、千层蘑、彩云革盖菌等, 隶属真菌门、担子菌亚门、多孔菌科、革盖菌属,是我国传统的名贵药材。云芝味甘、 淡, 性微寒, 有健脾利湿, 止咳平喘, 清热解毒,抗肿瘤的功效。云芝多糖是云芝的主要有效成分，能激活免设细胞、提高机体免疫功能，抗肿瘤、降血脂及抗菌，此外，云芝多糖对慢性应激引起的学习和记忆障碍等均有显著的改善效果，因此，云芝多糖可作为一种安全有效的活性物质，应用于保健食品中。云芝深层发酵可制得其中一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂-胃蛋白酶抑制剂，其不仅具有胃蛋白酶抑制剂的作用，还具有云芝多糖等云芝其他生理活性物质等的活性功能。目前，已有学者报道将云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂及其纯化，但存在操作繁琐或胃蛋白酶抑制剂产是不高等缺点。为此，本发明提供能一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，该方法可对胃蛋白酶抑制剂进行充分提取，且操作简单。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种云芝发酵胃蛋白酶抑制剂的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种云芝发酵提取胃蛋白酶抑制剂的方法，其特征于，包括以下步骤：

（1）样品预处理：取云芝3-5g冷冻干燥至恒重，粉碎过筛，取筛下样品粉末备用；

（2）菌种培养活化：取步骤（1）中制得的样品粉末置入斜面培养基中进行培养，得到活化的菌株；

（3）摇瓶发酵培养：取步骤（2）中活化的菌株置入发酵瓶中进行摇瓶发酵培养，得菌株发酵液；

（4）胃蛋白酶抑制剂的提取：将步骤（3）中制得的菌株发酵液进行超声波细胞破碎，离心，经大孔树脂脱色，取上清液透析后进行胃蛋白酶抑制剂的纯化,制得胃蛋白酶抑制剂。

优选的，其特征于，步骤（1）中所述的粉碎过筛为过40-80目筛。

优选的，步骤（2）中所述的斜面培养基的组分为：马铃薯15-25%，葡萄糖1-3%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁水合物0.1-0.3%，琼脂1-3%。

优选的，步骤（3）中所述的摇瓶发酵培养基的组分为：马铃薯汁30-50%，葡萄糖1-3%,硫酸镁水合物0.1-0.3%，硫酸钠0.03-0.08%，磷酸二氢钾0.1-0.5%。

优选的，步骤（2）中所述的斜面培养基及步骤（3）中所述的摇瓶种子培养基均为在121℃条件下湿热灭菌30-40min的培养基。

优选的，步骤（2）中所述的培养条件为：培养温度25-28℃，培养时间3-5d。

优选的，步骤（3）中所述的培养条件为：摇床速度200-220r/min，培养温度25-28℃，培养时间3-5d；步骤（4）中所述的超声波细胞破碎时的操作条件为：功率为250-300W，温度为20-25℃，时间为5-8min。

优选的，步骤（4）中所述的离心的速度为13000-150000r/min,离心时间为5-10min。

步骤（4）中所述的胃蛋白酶抑制剂的纯化的具体方法为：采用DEAE-52离子交换层析，以流动相A液洗脱2倍柱床体积后，以20%B液梯度洗脱，取透析后的上清液上样。

优选的，所述的流动相A液为0.02-0.05mol/L ,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，B液为0.5-0.8mol/L,PH为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液，所述的洗脱速度为0.8-1.0ml/min,上样量为3ml。

对步骤（4）中制得的胃蛋白酶抑制剂采用Lowry法测定浓度，采用常规蛋白酶测定法测定其活力。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：