[发明专利]一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

莱克多巴胺(RAC，结构式如图1)又称克伦巴安，是一种含有双苯烷胺类结构的β-肾上腺素受体激动剂，是一种能够通过与细胞膜上的β受体相结合后产生相应生理效应的人工合成的天然儿茶酚胺类似物，其作用与肾上腺素和去甲肾上腺素的作用相似，临床上一般用于治疗支气管哮喘、支气管痉挛等疾病，还可用于治疗肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。

莱克多巴胺用于饲养动物时，能够使动物体内的营养得到再分配，改变动物的营养代谢方式，减少脂肪生成，提高瘦肉率，更能迎合消费者的需求从而能够带来可观的经济效益。但是，如果β-受体激动剂在动物体内长期蓄积，则会通过食物链对消费者的身体健康造成威胁，严重时会引起心悸、肌肉震颤、恶心呕吐等中毒症状，尤其是对患有心脏病、糖尿病或者高血压的病人身体危害更大。

我国农业部在1997年颁布法令严禁使用β-受体激动剂作为动物饲料添加剂促进动物生长。中华人民共和国工业和信息化部、农业部、商务部、卫生部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，自2011年12月5日起在我国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。

目前，在美国、加拿大、巴西等24个国家仍允许将莱克多巴胺添加到动物饲料中来促进动物生长和提高瘦肉率，这成为非法使用者为牟取不正当利益的借口。莱克多巴胺仍活跃于市场的另一个重要原因，是目前的检测方法达不到要求。

目前莱克多巴胺的检测方法主要是色谱分析方法，其次是免疫分析方法。色谱分析方法虽然比较灵敏，准确度高，但需要大型仪器支持，需要繁琐的样品前处理以及专业的人员操作，不能适应市场对分析方法快速、简便的要求。免疫分析方法虽然快速、简便、特异性强、灵敏度高，不用繁琐的样品前处理、适合现场批量样品的检测等优点，但是酶联免疫试剂盒对检测莱克多巴胺特异性不理想，试剂盒的灵敏度不高，因此制备灵敏度高，特异性强的莱克多巴胺抗体是关键，而解决其问题关键取决于免疫半抗原的分子结构和分泌抗体的细胞系。

专利201210177057.X提供了一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原的制备方法，虽然半抗原的合成方法简单，纯度和产率较高，但是该半抗原是以莱克多巴胺原料为基础合成的，会增加莱克多巴胺检测的成本。

专利CN 102924601B提供了一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其半抗原也是以莱克多巴胺结构为基础进行合成的，不仅生产成本相对高，而且其制备单克隆抗体的灵敏度低。

为了解决上述问题，本发明的关键点从基础原料合成莱克多巴胺的类似物作为半抗原，降低检测成本，并且半抗原最大限度上保留莱克多巴胺的原有结构，而优化免疫抗原制备杂交瘤细胞分泌大量的抗体，提高抗体的特异性，灵敏度，增强抗体与抗原的识别能力。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种莱克多巴胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其制备方法和应用，利用该方法制备的莱克多巴胺检测单克隆抗体具有效价高、灵敏度高、特异性强、检测成本低廉的特点。

本发明主要有以下技术方案实现：

一种莱克多巴胺半抗原，其结构式为下式Ⅰ：

一种莱克多巴胺半抗原的制备方法，包括如下步骤：化合物1通过溴代反应得到中间体2；所述中间体2与丙烯酸乙酯反应得到中间体3；所述中间体3经还原反应得到中间体4；所述中间体4与化合物5反应得到中间体6；所述中间体6经水解反应得到所述莱克多巴胺半抗原7；

一种莱克多巴胺半抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(a)将所述化合物1溶于乙腈中，加入N-溴代丁二酰亚胺，所述化合物1与所述N-溴代丁二酰亚胺的加入量之比为1:1～1.5倍当量，室温下反应2-4h，得到所述中间体2；(b)在所述中间体2中加入[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，抽换氮气，加入三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺和丙烯酸乙酯，再次抽换氮气，90-110℃下回流搅拌反应15-20h，得到所述中间体3；(c)在所述中间体3中加入甲醇和催化剂Pd/C，抽换氢气，室温下反应3-6h，得到所述中间体4；(d)将所述中间体4溶于甲醇中，加入化合物5、三乙胺搅拌反应10-30min，加入三乙酰氧基硼氢钠，36-60℃下回流搅拌反应20-30h后，得到所述中间体6；(e)将所述化合物6溶于甲醇中，加入NaOH，50-70℃下回流搅拌反应5-7h，得到所述莱克多巴胺半抗原RAC-CA。