[发明专利]一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于冰冻切片的制备领域，特别涉及一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法。

背景技术

载玻片洁净处理(陈志忠，陈小岩，陈冰，陈惠玉等.介绍一种免疫组化染色防脱片制作方法[J].诊断病理学杂志.2011.18(6)：479-479)，将载玻片无规则散放入专用桶，经3％加酶洗衣粉溶液浸泡12-24h，适当震荡2-3次；流水冲洗至不再产生泡沫。蒸馏水冲洗>5次，至无群集泡沫产生.沥干后入95％乙醇4-8h，取出置60％烤箱中烤干备用。

制备防脱片剂工作液,现有的防脱片剂包括多聚赖氨酸和APES，将防脱片剂原液与蒸馏水按一定比例配制成工作液，储备于染色缸中备用。防脱片制作,戴塑料薄膜手套取出洁净后的载玻片，逐片竖直放入多聚赖氨酸工作液中，以相邻的载玻片之间不存气泡和间隙为标准,转入若干片后一齐层叠取出，并让层叠玻片外缘的工作液流干，然后玻片面向上平放入塑料平底容器，以相叠的玻片间不存气泡和间隙为标准.将盛片容器平稳放于60℃烤箱中，烤片8-24h，烤干即可取出冷却。

现有方法缺点：1、玻璃表面凹凸不平,其表面层的厚度和表面粗糙度大(张功学,方淑玲,郭世安,丁凯,等.一种节约型叠加法防脱玻片的制作方法[J].中国民族民间医药.2009.24.(1):202-202)，因多聚赖氨酸防脱片剂是水溶性溶液，故载玻片上杂质油脂如不去除干净，会成为载玻片表面与多聚赖氨酸防脱片剂间的接触障碍(徐婷,钟声旺,邱冬梅,等.改良多聚-L-赖氨酸法防脱片载玻片的制备[].南通大学学报.2011.31(4):311-312)，现有的方法只用洗衣粉和无水乙醇处理玻片，这样很难保证后续玻片涂胶质量。

RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐热、耐酸碱，煮沸也不能使之完全失活，蛋白变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在进行关于RNA实验操作中须避免外源性RNA酶的污染，现有方法并没有关于灭活外源性RNA酶的相关步骤。

现有的方法中常用的浸泡法,不仅试剂用量大,而且由于玻片在浸泡时堆放叠压,易使溶液涂布不均,即使一张一张地将玻片从多聚赖氨酸浸泡液中提出,玻片表面溶液呈水膜状,但在沥干或晾干的过程中,由于液体的分子热运动和表面张力作用,会使黏附剂溶液不断移动,面积缩小,玻片干燥后,留下不均匀分布的斑块状黏附剂痕迹,影响防脱片效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，本发明玻片易于标准化制作，操作简单，节约试剂。

本发明的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括：

(1)将载玻片浸入水中，捞出后加入热的洗衣粉水溶液中，热闷0.5-1h，然后冲洗，沥干，浸入乙醇中过夜，冲洗，进入重铬酸钾洗液中过夜，冲洗，洗涤，烘干，进行热处理，得到洁净的载玻片；

(2)取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加200ul浓度为0.1mg/ml多聚赖氨酸工作液；另取载玻片标记面向下，在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止，平放，烘干，干燥后分开，得到防脱玻片；

(3)预先用冰冻切片包埋剂-OCT(opti-mum cutting temperature compound)浸润组织，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，即得。

所述步骤(1)中冲洗为流水冲洗，冲洗时间均为5-15min。

所述步骤(1)中洗衣粉水溶液的质量百分浓度为5-8％；乙醇为无水乙醇。

所述步骤(1)中热的洗衣粉水溶液的温度为80-100℃。

所述步骤(1)中重铬酸钾洗液的为重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的混合溶液，其中重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的比例为20g：40ml：500ml。

所述步骤(1)中热处理在实验室用热风循环烘箱中完成，温度为160℃-180℃，处理时间为5h-6h。

所述步骤(2)中多聚赖氨酸工作液的配制为：配制1mg/ml的多聚赖氨酸母液，0.22um除菌滤膜过滤，分装后，-20℃避光保存；取出多聚赖氨酸母液与灭菌水按1:9比例配制成0.1mg/ml多聚赖氨酸工作液。

所述步骤(2)中滴加用移液枪(配去除RNA酶的进口枪头)吸取200ul多聚赖氨酸工作液，浓度为0.1mg/ml，滴加到载玻片上。