[发明专利]一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法

权利要求书

1.一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，包括：

(1)将载玻片浸入水中，捞出后加入热的洗衣粉水溶液中，保持较高的洗衣粉水温度0.5h-1h，然后冲洗，沥干，浸入乙醇中过夜，冲洗，进入重铬酸钾洗液中过夜，冲洗，洗涤，烘干，进行去除RNA酶的高温处理，得到洁净的载玻片；

(2)取洁净的载玻片，朝上面标记，滴加多聚赖氨酸工作液；另取载玻片标记面向下，在注有溶液的载玻片上从一端相互反向将溶液推向另一端，直至标记处停止，平放，烘干，干燥后分开，得到防脱玻片；

(3)预先用冰冻切片包埋剂浸润组织，固定到切片托上，冷冻腔放置，待组织块至表面白色，全部冷冻后放入切片机冷冻夹上进行切片，即得。

2.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中冲洗为流水冲洗，冲洗时间均为5-15min。

3.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中洗衣粉水溶液的质量百分浓度为5-8％；较高的洗衣粉水温度为80-100℃；乙醇为无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中重铬酸钾洗液的为重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的混合溶液，其中重铬酸钾、灭菌水、浓硫酸的比例为20g：40ml：500ml。

5.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中去除RNA酶的高温处理用热风循环烘箱完成，温度为160℃-180℃，处理时间为5h-6h。

6.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中多聚赖氨酸工作液的配制为：配制1mg/ml的多聚赖氨酸母液，0.22um除菌滤膜过滤，分装后，-20℃避光保存；取出多聚赖氨酸母液与灭菌水按1:9比例配制成0.1mg/ml工作液。

7.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中用移液枪吸取200ul多聚赖氨酸工作液，浓度为0.1mg/ml，滴加到载玻片上，其中移液枪所用枪头为去除RNA酶的枪头。

8.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中烘干温度为30-40℃。

9.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中切片的具体工艺参数为：冷冻腔-20℃，冷冻摇臂-25℃，切片厚度20um，冷冻腔放置时间为30-60min。

10.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)所得冰冻切片保存在-80℃。

11.根据权利要求1所述的一种microRNA原位杂交的冰冻切片的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中包埋剂为包埋剂-OCT。